青　維,孫　強(qiáng),白鑫華,冉　旭

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

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超濾對(duì)大鯢多肽抗氧化活性的影響

青維,孫強(qiáng),白鑫華,冉旭*

(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

大鯢,多肽,抗氧化活性,超濾

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱(Amphibia)有尾目(Caudata)隱腮鯢科(Cryptobrachidae)[1-2],屬于國(guó)家二級(jí)水生野生保護(hù)動(dòng)物。大鯢肌肉是一種低脂肪的優(yōu)質(zhì)蛋白源,具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值。大鯢肌肉蛋白必需氨基酸含量豐富,組成比例好,較為符合人體需要模式[3]。研究表明,大鯢肌肉蛋白酶解后得到的多肽不但具有清除自由基的能力,而且具有天然、安全、易吸收的優(yōu)勢(shì),攝入體內(nèi)具有提高機(jī)體抗氧化能力和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的雙重作用[4]。然而,目前對(duì)于食源性抗氧化肽構(gòu)效關(guān)系的研究還不夠深入。研究發(fā)現(xiàn),影響抗氧化能力的因子有很多:氨基酸的組成與排列順序、肽的疏水性與結(jié)構(gòu)、肽的分子量以及水解度都會(huì)影響到抗氧化肽的抗氧化能力[5],因此,不同分子量的大鯢多肽的抗氧化活性都會(huì)不同。

超濾是一種加壓膜分離技術(shù),即在一定壓力下,使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的濾膜,而且截留大分子溶質(zhì),從而使溶液中不同分子量的物質(zhì)得到分級(jí)分離。超濾技術(shù)因其具有操作方便、無(wú)相變、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于蛋白肽(如大豆肽[6]、乳蛋白多肽[7]、真鯛魚(yú)骨多肽[8]等)的分級(jí)分離,既可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的多肽,又有利于保持多肽的生理活性。郝更新等[9]采用超濾對(duì)牡蠣蛋白酶解產(chǎn)物中發(fā)揮抗氧化活性的肽片段進(jìn)行組分分離,發(fā)現(xiàn)<4 ku超濾液的還原力均高于同濃度的原液和其他超濾組分。而目前有關(guān)超濾對(duì)大鯢多肽抗氧化活性影響的研究報(bào)道較少。

本研究采用不同截留分子量的卷式聚砜超濾膜對(duì)大鯢肉蛋白酶解物進(jìn)行分級(jí)分離,通過(guò)3種體外自由基清除實(shí)驗(yàn),比較不同超濾組分多肽的抗氧化能力,為大鯢多肽在食品開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大鯢四川溪源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司;中性蛋白酶(2×105U/g)、風(fēng)味蛋白酶(1.5×104U/g)食品級(jí),江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;氯化硝基四氮唑藍(lán)、吩嗪硫酸甲酯、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、1,10-菲啰啉上海長(zhǎng)哲生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)Sigma公司;硫酸亞鐵、雙氧水等均為分析純,成都科龍化工試劑廠。

752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精科實(shí)業(yè)有限公司;HH-4恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司;JJ-60W電動(dòng)攪拌器上海喬楓實(shí)業(yè)有限公司;pHS-3C酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司;LGJ-30冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司;LJ6T-SY04/W1X膜澄清實(shí)驗(yàn)設(shè)備、聚砜卷式超濾膜成都連接流體分離科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鯢多肽的制備冷凍大鯢肌肉在室溫下解凍,然后洗凈切碎混勻,大小不超過(guò)1 cm3,按一定比例加入去離子水,用1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)至設(shè)定的pH,加酶恒溫?cái)嚢杳附狻⒄招礻?yáng)等[10]確定的大鯢多肽最佳酶解工藝條件:風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶添加量均為6000 U/g,酶解溫度55 ℃,酶解時(shí)間3 h,料液比1∶8(w/w),初始pH=6.86。酶解結(jié)束后將酶解液煮沸15 min滅酶,冷卻至室溫。上述酶解液經(jīng)0.22 μm微濾膜過(guò)濾即可得到得清澈大鯢多肽酶解液。

1.2.2大鯢多肽的膜分離分級(jí)在室溫條件下,依次采用截留分子量為20、5、2、0.3 ku的聚砜卷式超濾膜對(duì)大鯢多肽酶解液進(jìn)行超濾分級(jí)分離,得到5個(gè)不同分子量段的多肽液,將各級(jí)多肽液分別冷凍干燥(控制多肽粉水分含量在7%以下),得各分子量段的多肽:ADMAP-1(>20 ku)、ADMAP-2(5～20 ku)、ADMAP-3(2～5 ku)、ADMAP-4(0.3～2 ku)、ADMAP-5(<0.3 ku)。四級(jí)膜分離的分離壓力分別為0.1、0.15、0.25、0.45 MPa。具體膜分離工藝流程如下:

1.2.3不同超濾組分抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1DPPH自由基清除活性的測(cè)定DPPH自由基清除活性的測(cè)定方法參照Shimada等人[11]的方法,略作修改:將多肽粉配制成不同濃度樣品液,量取4 mL樣品液于試管中,加入4 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于95%乙醇),振蕩混勻后在室溫下避光反應(yīng)20 min,以去離子水調(diào)零,在517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)i;空白組為4 mL樣品液,加入4 mL 95%乙醇溶液,測(cè)定吸光值為Aj;對(duì)照組為4 mL DPPH溶液加上4 mL去離子水,測(cè)定吸光值為A0。DPPH清除率按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中:Ai:樣品組吸光值;Aj:空白組吸光值;A0:對(duì)照組吸光值。

1.2.3.2·OH自由基清除活性的測(cè)定·OH自由基清除活性的測(cè)定參照Wang等[12]的方法。在該法中,H2O2和Fe2+發(fā)生Feton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH自由基能將二價(jià)鐵離子氧化成三價(jià)鐵離子。二價(jià)鐵離子能與1,10-菲啰啉結(jié)合生成紅色化合物,該化合物在波長(zhǎng)為536nm處有吸收。

取1mL1,10-菲啰啉(1.865mmol/L)與2mL樣品液于具塞試管中混合,再加入1mLFeSO4·7H2O(1.865mmol/L),最后加入1mLH2O2溶液(0.03%,v/v),將試管置于37 ℃溫度下反應(yīng)60min,于536nm處測(cè)量吸光度A,同時(shí)以蒸餾水代替樣品液作陰性對(duì)照Aj,以蒸餾水代替過(guò)氧化氫作空白對(duì)照A0。樣品對(duì)·OH自由基的清除率按公式(2)計(jì)算。

(2)

式中:A:樣品組吸光度;Aj:陰性對(duì)照吸光度;A0:空白對(duì)照組吸光度。

(3)

式中:A0:空白對(duì)照吸光度;A:樣品組吸光度。

1.2.4水解度的測(cè)定

1.2.4.1總氮和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB 5009.5-2010采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.4.2游離氨基態(tài)氮的測(cè)定參考趙新淮等人[14]的甲醛滴定法測(cè)定大鯢酶解液中的游離氨基態(tài)氮含量。

1.2.4.3水解度的計(jì)算依據(jù)公式(4)計(jì)算水解度(DH):

(4)

1.2.5多肽得率的測(cè)定多肽得率是指酶解液中多肽含量占原料總蛋白質(zhì)的百分比。首先參照魯偉等人[15]的方法,采用加入等量的10%(W/V)三氯乙酸沉淀大分子蛋白質(zhì),然后采用雙縮脲法測(cè)定酶解液中多肽的含量,具體步驟參照《2010版中國(guó)藥典》的《蛋白質(zhì)含量測(cè)定法》。多肽得率的計(jì)算如公式(5)。

表1　大鯢肉酶解液超濾分級(jí)結(jié)果

(5)

2　結(jié)果與分析

2.1大鯢抗氧化肽超濾分級(jí)

大鯢肉酶解液經(jīng)超濾分級(jí)后冷凍干燥,所得組分采用直接干燥法測(cè)水分含量。各組分含量如表1所示。

由表1可知,大鯢肉酶解液經(jīng)0.22 μm微濾膜處理后,酶解液中多肽分子量均小于20 ku。酶解液中各組分含量依次是:ADMAP-4>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,大鯢酶解物中82.5%為分子量0.3～5 ku的多肽,說(shuō)明超濾可有效分離各分子量段抗氧化肽。

2.2不同超濾組分對(duì)DPPH自由基的清除作用

不同超濾組分不同濃度對(duì)DPPH自由基的清除作用如圖1所示。

圖1　不同超濾組分對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1　DPPH· scavenging activity of different UF fractions

由圖1可以看出,大鯢多肽濃度在0～4 mg/mL的范圍內(nèi),各超濾組分DPPH自由基清除率隨著大鯢多肽濃度的增加而不斷上升。當(dāng)大鯢多肽濃度超過(guò)4 mg/mL后,DPPH自由基清除能力無(wú)顯著提高。由于EC50(ADMAP-2)>EC50(ADMAP-5)>EC50(ADMAP-3)>EC50(ADMAP)>EC50(ADMAP-4),說(shuō)明大鯢多肽各超濾組分對(duì)DPPH·自由基清除能力從大到小的順序?yàn)?ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。當(dāng)各組分濃度為4 mg/mL時(shí),清除率由高到低依次為93.24%、91.67%、82.32%、80.57%、55.69%。其中,ADMAP-4表現(xiàn)出的清除能力最強(qiáng)(p<0.05),比同濃度VC對(duì)DPPH·自由基的清除活性低2.54%,有明顯差異(p<0.05),其EC50值為0.4 mg/mL。ADMAP-2表現(xiàn)出的清除能力最小,說(shuō)明分子量過(guò)大的多肽對(duì)DPPH自由基清除能力較低。超濾前的ADMAP也表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力,其EC50約為1 mg/mL。結(jié)果表明,超濾處理能夠有效分離得到大鯢多肽中對(duì)DPPH·自由基清除活性較強(qiáng)的組分。如圖1所示,不同分子量分布的大鯢多肽對(duì)DPPH自由基清除活性不同(p<0.05),分子量在0.3～2 ku范圍內(nèi)的多肽清除DPPH自由基能力最強(qiáng)。

2.3不同超濾組分對(duì)·OH自由基的清除作用

不同超濾組分不同濃度對(duì)·OH自由基的清除作用如圖2所示。

圖2　不同超濾組分對(duì)·OH自由基的清除作用Fig.2　·OH scavenging activity of different UF fractions

由圖2可以看出,大鯢多肽濃度在0～4 mg/mL的范圍內(nèi),隨著大鯢多肽濃度的增加,各超濾組分·OH自由基清除率不斷上升,表明大鯢多肽不同超濾組分對(duì)·OH自由基的清除率具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)大鯢多肽濃度超過(guò)4 mg/mL后,·OH自由基清除能力變化不明顯。在多肽濃度相同時(shí),各組分對(duì)·OH自由基清除能力依次為:ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2。如表1所示,各組分的分子量大小順序?yàn)?ADMAP-2>ADMAP-3>ADMAP-4>ADMAP-5。由上述結(jié)果可以推斷得出:各超濾組分的分子量太大或太小,大鯢多肽的·OH自由基清除活性都不高,適中分子量范圍(0.3～2 ku)的大鯢多肽·OH自由基清除活性最強(qiáng)。

圖3　不同超濾組分對(duì)自由基的清除作用Fig.· scavenging activity of different UF fractions

3　結(jié)論

大鯢多肽酶解液經(jīng)20、5、2、0.3 ku的超濾膜超濾分離后得到四種不同分子量范圍的多肽,大鯢酶解物中82.5%的多肽分子量集中在0.3～5 ku。在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中,各超濾組分均表現(xiàn)出一定的體外抗氧化能力,且各超濾組分與酶解原液的清除DPPH·能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力均為ADMAP-4>ADMAP>ADMAP-3>ADMAP-5>ADMAP-2,說(shuō)明分子量在0.3～2 ku的大鯢多肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力,這一結(jié)果為大鯢抗氧化多肽在保健食品的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of UF(ultrafiltration)on the antioxidant activity ofAndriasdavidianuspeptides

QING Wei,SUN Qiang,BAI Xin-hua,RAN Xu*

(College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Andriasdavidianus;peptides;antioxidant activity;ultrafiltration

2016-03-30

青維(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：qwlbl702@sina.com。

冉旭(1968-)，男，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：ranxu01@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)18-0139-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.018