邢效娟,劉建壘,景　浩

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

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卵白蛋白-油酸復(fù)合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的HAMLET樣生長(zhǎng)抑制作用研究

邢效娟,劉建壘,景浩*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

乳白蛋白與油酸形成的復(fù)合物具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)。本文制備了卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)和油酸(Oleic acid,OA)的復(fù)合物(OVA-OA),通過檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞生長(zhǎng)周期和凋亡的變化,分析了OVA-OA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)的生長(zhǎng)抑制作用以及其中OA對(duì)生長(zhǎng)抑制作用的貢獻(xiàn)。結(jié)果表明,當(dāng)OVA-OA中OA的濃度達(dá)到182 μmol/L時(shí),OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞有顯著(p<0.05)生長(zhǎng)抑制作用,273 μmol/L時(shí)生長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng),且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)(1～3 h)而增強(qiáng)。在182 μmol/L時(shí),OA對(duì)Caco-2細(xì)胞也有生長(zhǎng)抑制作用,其劑量效應(yīng)關(guān)系與OVA-OA一致。但當(dāng)OA濃度為273 μmol/L時(shí),其生長(zhǎng)抑制作用弱于OVA-OA的。OVA-OA和OA均會(huì)促使乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放,增大晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比,阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期和S期。由此可知,OVA-OA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有HAMLET樣生長(zhǎng)抑制作用,其中OA起主要作用。OVA-OA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是通過損傷細(xì)胞膜、阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

卵白蛋白,油酸,細(xì)胞生長(zhǎng)抑制,乳酸脫氫酶,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期

Hakansson和Svanborg等[1]發(fā)現(xiàn)母乳中含有一種能特異性促使人肺癌細(xì)胞凋亡的物質(zhì),用蛋白質(zhì)電泳確定其分子量后發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的分子量與α-乳白蛋白(α-Lactalbumin,α-LA)相近,但經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)α-LA本身并不能引起肺癌細(xì)胞的凋亡,因此當(dāng)時(shí)稱這種物質(zhì)為乳白蛋白多聚體(multimericα-LA)。經(jīng)過5年的研究,Svensson等[2]證明這種聚合物是α-LA與油酸(Oleic acid,OA)的復(fù)合物,并將其命名為HAMLET。Tolin等[3]通過胃蛋白酶將α-LA進(jìn)行酶解,再用α-LA肽段與OA混合制備復(fù)合物,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物也有HAMLET樣的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。隨著研究的進(jìn)行,發(fā)現(xiàn)其他類型的蛋白質(zhì),比如馬溶菌酶[4]、β-乳球蛋白[5]、乳鐵蛋白[6]也可以與OA形成有HAMLET樣細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的復(fù)合物,而相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)沒有這種作用。

卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)約占蛋清蛋白含量的54%,屬于含磷糖的糖蛋白,分子量為45 ku,等電點(diǎn)為4.5[7]。目前只有一些OVA與不飽和脂肪酸相互作用的報(bào)道,例如OA的結(jié)合使得OVA的熒光強(qiáng)度降低,二級(jí)結(jié)構(gòu)變得更加松散[8],加熱后的OVA可以與亞油酸(Linoleic acid,LA)通過疏水鍵相互作用[9]。但對(duì)結(jié)合后的OVA-OA的生物活性,尤其是是否具有HAMLET樣的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用還未見報(bào)道。

一般認(rèn)為α-LA-OA的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用不是由OA引起的,而是復(fù)合物特有的性質(zhì)。Kamijima等[10]研究α-LA-OA對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株L1210細(xì)胞生長(zhǎng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)即使當(dāng)OA濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí),也沒有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,而經(jīng)α-LA-OA作用后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為90%左右。Fang等[11]研究α-LA-OA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)和人早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)等細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)OA濃度低于100 μmol/L時(shí),對(duì)細(xì)胞沒有生長(zhǎng)抑制作用。但近年來有些研究者報(bào)道,HAMLET中起生長(zhǎng)抑制作用的成分為OA,例如α-LA-OA可以抑制HL-60細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞(Hela)的生長(zhǎng),但相應(yīng)濃度的OA(0～100 μmol/L)也有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用[12-13]。因此,對(duì)于OA以及OA與蛋白質(zhì)復(fù)合物的物化特性和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用還需進(jìn)一步研究。

在本研究中,以人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)為模型,分析研究OVA-OA的HAMLET樣細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用以及OA對(duì)OVA-OA的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的貢獻(xiàn)。通過LDH法、流式細(xì)胞技術(shù)分析OVA-OA對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞生長(zhǎng)周期和細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

卵白蛋白(純度≥99%,Ca. No. 1021845)和油酸(純度≥99.5%,Cat. No.112-80-1)均購(gòu)于成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司;DMEM(Dulbeco’s modified eagle medium)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(Thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、不含DNA的RNA酶、碘化丙啶(Propidium iodide,PI)、輔酶I(β-Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于上海貝博生物;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為高純?nèi)ルx子水(deionized water,18 Ω;dH2O);人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板均購(gòu)于無(wú)錫耐思生物科技有限公司。

Model 680型酶標(biāo)儀美國(guó)BIO-RAD公司;FACSCalibur II型流式細(xì)胞儀美國(guó)BD公司;MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱日本Sanyo(三洋)公司;BSC-1500 II A2-X型生物安全柜濟(jì)南市鑫貝西生物技術(shù)有限公司;pHs-3C+型酸度計(jì)成都世紀(jì)方舟科技有限公司;XB220A型電子天平瑞士Precisa Gravimetrics AG公司;Vortex-Genie 2漩渦振蕩器美國(guó)Scientific Industries公司;FM200型實(shí)驗(yàn)室分散乳化機(jī)上海弗魯克液體機(jī)械制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1OVA-OA的制備用pH8.0的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer solution,PBS)配制10 mg/mL的OVA儲(chǔ)備液,離心(1460×g,10 min)后取上清4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。用無(wú)水乙醇溶解OA配制成1 mol/L的儲(chǔ)備液,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?使用前用PBS將OA稀釋為1 mmol/L的工作液,再用乳化機(jī)均質(zhì)(8000～10000 r/min,1 min),制成OA混懸液。將不同體積的OA混懸液加入到含有2 mL,OVA儲(chǔ)備液(10 mg/mL)的離心管中,再加入不同體積的PBS至10 mL,漩渦振蕩均勻,配制成不同摩爾比的OA與OVA的混合溶液,其中OVA濃度恒定為2 mg/mL。再將其置于70 ℃水浴加熱20 min,水浴結(jié)束后置于冰水中迅速冷卻,待測(cè)。同時(shí)將OVA,OA加熱,研究加熱對(duì)兩者細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的影響。

OVA-OA組中OVA的濃度為2 mg/mL(45.5 μmol/L),OA的濃度分別為0、91、182、273 μmol/L(OA與OVA的摩爾比分別為0∶1、2∶1、4∶1、6∶1),乙醇濃度低于0.5%;OA組濃度分別為0、91、182、273 μmol/L。

1.2.2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)將Caco-2細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板,每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋孔底面積的70%后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL的樣品溶液,置于培養(yǎng)箱孵育1、2、3 h后棄去樣品,加入100 μL的DMEM10(含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基),于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入70 μL含0.5 mg/mL MTT的DMEM,避光孵育3 h后小心棄去上清,加入70 μL鹽酸-異丙醇,在vortex上振蕩(800 r/min,10 min)。測(cè)定其在570 nm處吸光值[14-15]。根據(jù)公式(1)計(jì)算經(jīng)不同樣品作用后的細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=A樣品570 nm/A對(duì)照570 nm×100

式(1)

1.2.3乳酸脫氫酶釋放率檢測(cè)Tris-pyruvate-NADH反應(yīng)液配制:使用前,取100 mL Tris-EDTA緩沖液(pH7.4),分別加入1 mL丙酮酸鈉儲(chǔ)備液(135 mmol/L)和1 mL NADH儲(chǔ)備液(17 mmol/L),混勻,并在37 ℃水浴中孵育15 min以上,備用。

將Caco-2細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于直徑為100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,每皿加入10 mL的細(xì)胞懸液,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋孔底面積的80%～90%后棄去培養(yǎng)基,每孔加入3 mL的樣品溶液,置于培養(yǎng)箱孵育3 h后收集樣品溶液,離心(400×g,10 min)取上清,待測(cè)。取70 μL上清液與700 μL預(yù)熱(37 ℃)的Tris-pyruvate-NADH反應(yīng)液(其中Tris,pyruvate,NADH的終濃度分別為50、1.22、0.154 mmol/L)快速混合,立即測(cè)定其在340 nm處吸光值,每隔30 s記錄一次,連續(xù)記錄3 min,以反應(yīng)最初吸光值下降最快部分(如0～1 min或0～2 min)求線性回歸方程(時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)),其斜率絕對(duì)值即為每分鐘Abs340 nm的減少值(ΔAbs340 nm)。根據(jù)公式(2)計(jì)算LDH釋放率[14]。

表1　加熱對(duì)OVA與OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的影響

注:樣品作用時(shí)間為3 h,不同大寫字母A～C表示同列不同均數(shù)差異顯著(p<0.05);不同小寫字母a～f表示同行不同均數(shù)差異顯著(p<0.05);表2、表3同。

表2　在不同濃度和不同作用時(shí)間時(shí)OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

LDH釋放率(%)=ΔAbs340 nm,sample/ΔAbs340 nm,control×100

式(2)

式中ΔAbs340 nm為反應(yīng)體系每分鐘Abs340 nm的減少值。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)按照1.2.3中的方法進(jìn)行種盤和樣品處理,樣品處理結(jié)束后棄去樣品,每皿加入8 mL的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,消化,離心(100×g,5 min)收集細(xì)胞,用預(yù)冷(4 ℃)的PBS洗滌細(xì)胞兩次,洗凈胰酶和EDTA。用400 μL Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到流式管中,加入5 μL Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻,于2～8 ℃避光孵育15 min;上機(jī)檢測(cè)前加入10 μL PI染液,輕輕混勻,于2～8 ℃避光條件下孵育5 min,上機(jī)檢測(cè)[16]。另用未染色的及Annexin V單染的對(duì)照組細(xì)胞對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

流式細(xì)胞儀采用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm檢測(cè)FITC和620 nm檢測(cè)PI,FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測(cè),PI紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測(cè)。用Cell Quest軟件分析得到不同凋亡期細(xì)胞的百分比。

1.2.5細(xì)胞周期檢測(cè)按照1.2.4中的方法處理細(xì)胞至預(yù)冷PBS洗凈胰酶和EDTA后,加入300 μL PBS并重懸細(xì)胞,緩慢加入700 μL預(yù)冷(-20 ℃)的無(wú)水乙醇(乙醇終濃度為70%),-20 ℃固定1 h;離心(100×g,5 min)棄上清,用5 mL預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次;加0.25 mL PBS重懸細(xì)胞,并轉(zhuǎn)移到流式管中,加入13 μL 10 mg/mL的RNA酶(終濃度0.5 mg/mL),37 ℃避光孵育1 h;加入14 μL 1 mg/mL的PI(終濃度50 μg/mL),4 ℃避光30 min左右后,用流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)620 nm),并用Modfit軟件分析得到不同生長(zhǎng)周期細(xì)胞的百分比[17]。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。采用Minitab 17.1.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),進(jìn)一步用Turkey多重比較確定各組數(shù)據(jù)間的顯著性差異,顯著水平為設(shè)定為p<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

采用不同摩爾比的OA與OVA(OVA 2 mg/mL;OA與OVA的摩爾比為0∶1、2∶1、4∶1、6∶1)制備OVA-OA復(fù)合物。首先研究加熱對(duì)OVA與OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的影響(表1);再同時(shí)用OVA-OA和與OVA-OA中相應(yīng)濃度的OA(0、91、182、273 μmol/L)作用于Caco-2細(xì)胞,比較兩者的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用(表2)。

由表1可知，未加熱時(shí),OVA對(duì)Caco-2細(xì)胞沒有生長(zhǎng)抑制作用;濃度為91 μmol/L時(shí),OA也沒有生長(zhǎng)抑制作用;182 μmol/L時(shí),對(duì)細(xì)胞有顯著的(p<0.05)生長(zhǎng)抑制作用,且273 μmol/L時(shí)抑制作用增強(qiáng)。加熱后,OVA、OA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用均與未加熱時(shí)沒有顯著性差異。所以,加熱并不會(huì)影響OVA和OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

當(dāng)OVA-OA中OA的濃度為91 μmol/L時(shí),對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)生長(zhǎng)抑制作用(1～3 h);182 μmol/L時(shí),對(duì)細(xì)胞有顯著的(p<0.05)生長(zhǎng)抑制作用,273 μmol/L時(shí)抑制作用增強(qiáng),且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在濃度較低(91、182 μmol/L)時(shí),OA與OVA-OA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用相當(dāng);但當(dāng)OA濃度為273 μmol/L時(shí),其生長(zhǎng)抑制作用明顯弱于OVA-OA的;作用時(shí)間相同時(shí),OA的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比OVA-OA低8%～10%。

表3　不同濃度OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的LDH活性和釋放率的影響

研究發(fā)現(xiàn)α-LA-OA對(duì)肺、腎、結(jié)腸、膀胱、前列腺[1]、肝臟、乳腺[18]、喉[19]等來源的腫瘤細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用。本研究顯示,OVA-OA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)也有HAMLET樣生長(zhǎng)抑制作用。Zhu等[20]研究OA對(duì)人類神經(jīng)母瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,發(fā)現(xiàn)OA致SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與時(shí)間和濃度呈依賴性,當(dāng)OA的濃度為200 μmol/L,作用3 h時(shí),細(xì)胞的抑制率約為35%;作用6 h時(shí),細(xì)胞的抑制率約為55%。Lima等[21]也發(fā)現(xiàn)OA對(duì)淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat)和惡性淋巴瘤細(xì)胞(Raji)有生長(zhǎng)抑制作用。在本實(shí)驗(yàn)中,OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制也呈時(shí)間和濃度依賴,在273 μmol/L時(shí)作用3 h可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)率至47.7%。

Brinkmann等[12]研究α-LA-OA對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,發(fā)現(xiàn)OA(濃度為0～100 μmol/L)與α-LA-OA對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出相似的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,且α-LA-OA的生長(zhǎng)抑制作用略高于OA。Permyakov等[19]研究發(fā)現(xiàn)α-LA-OA對(duì)人喉頭癌細(xì)胞(HEp-2)的半抑制率濃度為(IC50值)240 μmol/L(用OA的濃度表示),而OA單獨(dú)存在時(shí)IC50值為300 μmol/L,α-LA單獨(dú)存在時(shí)沒有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。所以α-LA-OA中發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的成分主要是OA,而α-LA可能主要起增加OA溶解度與運(yùn)輸OA的作用。在本實(shí)驗(yàn)中OVA本身沒有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,OA具有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,且濃度相同時(shí)OVA-OA生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于OA,所以在OVA-OA中發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的成分是OA,OVA可能主要通過增加OA溶解度或運(yùn)輸OA來提高OA自身的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。

2.2OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞膜的破壞作用

根據(jù)表2可知樣品作用時(shí)間為3 h時(shí),OVA-OA及OA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng),所以選擇作用3 h研究其對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用(表3)。

當(dāng)OVA-OA中的OA濃度為91 μmol/L時(shí),細(xì)胞的LDH釋放率沒有顯著(p<0.05)變化;182 μmol/L時(shí),細(xì)胞的LDH釋放率顯著增大,增大為對(duì)照組的4.5倍;273 μmol/L時(shí)LDH的釋放率進(jìn)一步增大,為對(duì)照組的10.8倍。在濃度較低(91和182 μmol/L)時(shí),OA與OVA-OA對(duì)細(xì)胞LDH釋放率的影響相當(dāng);但當(dāng)OA濃度為273 μmol/L時(shí),OA對(duì)細(xì)胞LDH的釋放率明顯低于OVA-OA,約低25%。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是存在于細(xì)胞內(nèi),參與糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化的一種酶,當(dāng)細(xì)胞膜受損傷時(shí),釋放的LDH會(huì)增加,故細(xì)胞膜釋放的LDH增加通常反映細(xì)胞膜受損傷,膜通透性增大[14]。所以O(shè)A濃度為182,273 μmol/L時(shí),OA與OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞的膜造成了損傷,致使LDH釋放,且273 μmol/L時(shí)OVA-OA對(duì)細(xì)胞膜的損傷程度更大。Mossberg等[21]用蛋黃磷脂酰膽堿或大豆卵磷脂組成單膜囊泡模仿熒光分子標(biāo)記的α-LA-OA與細(xì)胞膜的相互作用,發(fā)現(xiàn)α-LA-OA能夠結(jié)合人造細(xì)胞膜,增大膜的流動(dòng)性,同時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)泄漏到細(xì)胞外,而未結(jié)合OA的α-LA并沒有對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用,與本研究的結(jié)果一致。Mossberg等[21]也研究了α-LA-OA與從肺癌細(xì)胞A549中提取的質(zhì)膜的作用,發(fā)現(xiàn)α-LA-OA也可以與其結(jié)合,但與人造細(xì)胞膜不同的是α-LA-OA在質(zhì)膜中的分布不均勻,這說明癌細(xì)胞的膜中可能有α-LA-OA特定的高親和位點(diǎn)。

2.3OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)表2可知樣品作用時(shí)間為3 h時(shí),OVA-OA及OA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng),所以選擇作用3 h研究OVA-OA和OA對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響,探討經(jīng)樣品處理后不同時(shí)期凋亡的細(xì)胞百分比變化(圖1和表4)。

當(dāng)OVA-OA復(fù)合物中OA的濃度為91 μmol/L時(shí),細(xì)胞的凋亡沒有顯著(p<0.05)變化;182 μmol/L時(shí),晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比開始顯著增大,增大了約12%,而早期凋亡的細(xì)胞百分比沒有變化;273 μmol/L時(shí)晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比進(jìn)一步增大,增了約24%,早期凋亡細(xì)胞百分比也增大了3%左右。當(dāng)OA濃度為91,182,273 μmol/L時(shí),OA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響均與OVA-OA一致。所以,OVA-OA和OA可以增大晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比,且高劑量時(shí)(273 μmol/L)OVA-OA也可以使早期凋亡細(xì)胞百分比增多。

圖1　不同濃度OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響Fig.1　Cell apoptosis effects of OA and OVA-OA at different concentrations注:A:不同濃度的OA組;B:含不同濃度OA的OVA-OA組。左上象限顯示機(jī)械性損傷細(xì)胞(damaged),為Annexin V-/PI+;右上象限顯示凋亡晚期或者繼發(fā)性壞死細(xì)胞(late apoptosis/necrosis),為Annexin V+/PI+;左下象限顯示活細(xì)胞(viable),為Annexin V-/PI-;右下象限顯示早期凋亡細(xì)胞(early apoptosis),為Annexin V+/PI-。

表4　不同濃度OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞凋亡的影響

注:不同字母小寫字母表示同列不同均數(shù)差異顯著(p<0.05);表5同。

OVA-OA和OA可以使晚期凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)增多,而晚期凋亡和壞死細(xì)胞的膜遭到破壞[22],說明OVA-OA和OA可以破壞Caco-2的細(xì)胞膜,與LDH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。Fang等[11]用α-LA-OA作用Caco-2細(xì)胞24 h后,細(xì)胞的凋亡率約為50%,其中晚期凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)占39.54%。Brinkmann等[12]研究α-LA-OA作用3 h后對(duì)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)凋亡的影響,也得出了相似的結(jié)論。所以蛋白質(zhì)和油酸的復(fù)合物可以增大晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比。

表5　不同濃度OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

2.4OVA-OA對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響

根據(jù)表2可知,樣品作用時(shí)間為3 h時(shí),OVA-OA及OA對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng),所以選擇作用3 h研究OVA-OA和OA對(duì)Caco-2細(xì)胞周期的影響,探討經(jīng)樣品處理后處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞百分比變化(圖2和表5)。

圖2　不同濃度OVA-OA及OA對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響Fig.2　Cell cycle distribution effects of OA and OVA-OA at different concentrations注:A:不同濃度的OA組;B:含不同濃度OA的OVA-OA組。

當(dāng)OVA-OA復(fù)合物中OA濃度為91 μmol/L時(shí),細(xì)胞周期分布沒有發(fā)生變化;而濃度為182,273 μmol/L時(shí),G2期和M期的細(xì)胞百分比顯著(p<0.05)降低,降低了10%左右,G0和G1期、S期細(xì)胞百分比均有增加的趨勢(shì)。當(dāng)OA濃度為91、182、273 μmol/L時(shí),OA對(duì)細(xì)胞周期的影響均與OVA-OA一致。所以O(shè)VA-OA和OA主要通過減少G2期和M期的細(xì)胞百分比，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期和S期來影響細(xì)胞周期分布。

細(xì)胞周期是指一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂的結(jié)束,細(xì)胞由一個(gè)分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的過程,包括休眠期/DNA合成前期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和細(xì)胞分裂期(M期)[23-24]。OVA-OA及OA處理Caco-2細(xì)胞后,可以顯著減少G2期和M期的細(xì)胞百分比,說明經(jīng)OVA-OA及OA的處理會(huì)影響細(xì)胞DNA的合成,使細(xì)胞難以進(jìn)入DNA合成后期和分裂期,進(jìn)而影響細(xì)胞分裂。方冰[16]研究α-LA-OA對(duì)HT-29細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)α-LA-OA會(huì)影響染色體的分裂,使細(xì)胞阻滯在G2/M期,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。

3　結(jié)論

卵白蛋白和油酸復(fù)合物(OVA-OA)對(duì)人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞具有HAMLET樣的生長(zhǎng)抑制作用,其中OA起主要作用。OVA-OA中的OA劑量越大、作用時(shí)間越長(zhǎng),則細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)。OVA-OA的癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用是通過損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致LDH釋放率增大;使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期和S期從而阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期;使晚期凋亡和壞死的細(xì)胞百分比增多來實(shí)現(xiàn)的。

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HAMLET-like cell-growth-inhibitory effect of ovalbumin-oleic acid complex on colon cancer cell

XING Xiao-juan,LIU Jian-lei,JING Hao*

(College of Food Science & Nutritional Engineering,China Agriculture University,Beijing 100083,China)

A complex ofα-lactalbumin and oleic acid has previously been shown to have growth-inhibitory effect on cancer cells(Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET). Ovalbumin and oleic acid complex was prepared and its cell growth inhibition effect,along with contribution of oleic acid,were all evaluated on Caco-2 cell by using cell-growth inhibition,cellular membrane integrity,cell cycle and apoptosis assays. The result showed that OVA-OA significantly(p<0.05)inhibited cell growth at 182 μmol/L(OA),and the inhibitory effect was enhanced as the concentration was increased to 273 μmol/L. The inhibitory effect was also increased as incubation time was extended in a time-dependent manner. OA at 182 μmol/L also exhibited remarkable cell-growth-inhibitory effect in a similar pattern to OVA-OA,while its inhibitory effect was lower than that of OVA-OA at the same OA concentration of 273 μmol/L. Both OVA-OA and OA could increase LDH release rate,lead to cycle arrested at G0/G1and S phases,and induce apoptosis. In conclusion,the complex of OVA and OA has HAMLET-like cell-growth-inhibitory effect,which could be mainly contributed to OA. The mechanisms were associated with damage of cellular membrane integrity,arrest of cell cycle and induction of cell apoptosis.

ovalbumin;oleic acid;cell-growth inhibition;lactate dehydrogenase;cell apoptosis;cell cycle

2016-03-30

邢效娟(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)與小分子相互作用，E-mail：x2010314024@163.com。

景浩(1957-)，男，博士，教授，研究方向：分子營(yíng)養(yǎng)與食品安全，E-mail：haojing@cau.edu.cn。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題子課題(2012BAD28B08)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)18-0137-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.017