李姝靜,周自若,周　威,白冬生

(北京工商大學理學院化學系,北京 100048)

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HP-β-CD對桑色素的包合作用及光穩(wěn)定性研究

李姝靜,周自若,周威,白冬生

(北京工商大學理學院化學系,北京 100048)

以羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)為主體,采用冷凍干燥法制備水溶性良好的桑色素/HP-β-CD包合物。根據(jù)相溶解法研究了主客體之間的包合作用,并利用掃描電子顯微鏡(SEM)、粉末X 射線衍射譜圖(XRD)表征了包合物形成。此外,還通過差示掃描量熱法(DSC)、熱重分析(TG)及光穩(wěn)定性分析的方法探究了包合前后桑色素光、熱穩(wěn)定性的變化。實驗表明:桑色素與HP-β-CD形成了摩爾比1∶1的包合物,締合常數(shù)為833(mol/L)-1。包合后桑色素的水溶性得到提升,在加入了8×10-3mol/L的HP-β-CD后,其溶解度提升了7倍。此外,經(jīng)包合后的桑色素光、熱穩(wěn)定性也到提升,熱分解溫度從294 ℃提升至341 ℃,在300 min內(nèi)的光穩(wěn)定性也由75.2%提升至82.7%。這為桑色素作為食品添加劑在儲存及使用過程中穩(wěn)定性的提升提供了重要的幫助。

桑色素,羥丙基-β-環(huán)糊精,包合物,熱穩(wěn)定性,光降解

桑色素,化學名稱為2′,3,4′,5,7-五羥基黃酮,是一種天然的生物類黃酮,廣泛存在于?？浦参镏?如番石榴葉片、黃顏木等[1-2]。由于其顏色顯棕黃色,但難溶于水,只溶于有機溶劑,常常僅作為一種化工色素使用。此外,桑色素也是一種很強的生物活性劑,具有抗炎[3-4]、抗氧化[5]以及抗癌[6-7]等作用,因其結(jié)構(gòu)存在大π鍵共軛體系,具有較高的超離域度,也可作為金屬離子良好的配合物[8],因此可以應用于食品、藥品等多種領(lǐng)域。但是,由于桑色素較低的水溶性及易受外界環(huán)境中紫外線(UVB)影響[9],從而限制了其發(fā)展應用。

環(huán)糊精(CDs)是由多個吡喃葡萄糖單元經(jīng)α-1,4-糖苷鍵連接形成的環(huán)狀低聚糖。環(huán)糊精因具有親水的外殼及疏水的空腔,可與一些疏水性的客體分子包合形成包合物,從而提高客體分子的水溶性及穩(wěn)定性。最常見的環(huán)糊精一般含6,7,8個吡喃葡萄糖單元,分別叫做α-,β-,γ-CD[10]。其中,β-CD因為價格低廉,空腔大小適合包合一些常見的疏水性物質(zhì)而使用最為廣泛[11]。研究發(fā)現(xiàn),羥烷基化β-環(huán)糊精衍射物(如HP-β-CD)相比β-CD擁有更高的水溶性且無毒副作用,常用來代替β-CD包合一些難溶性分子[12]。因此,本實驗選取了HP-β-CD為主體,桑色素為客體分子,研究主客體之間的相互作用,并在此基礎(chǔ)上進一步探究桑色素對抗光、熱時的穩(wěn)定性變化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桑色素上海阿拉丁生化科技股份有限公司;羥丙基-β-環(huán)糊精上海西寶生物科技有限公司;其它試劑均為分析純。

N-1100V-W(WD)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀東京理化器械株式會社;CARY-60分光光度計美國瓦里安公司;D/MAX 2500V/PC X射線衍射儀德國布魯克公司;DTG-60AH熱重分析儀日本島津公司;TESCAN VEGA Ⅱ掃描電鏡捷克泰思肯公司。

1.2實驗方法

1.2.1制備方法

1.2.1.1桑色素/HP-β-CD包合物的制備采用冷凍干燥法制備桑色素/HP-β-CD包合物。桑色素溶于甲醇溶液,HP-β-CD用去離子水溶解。將桑色素溶液緩慢加入HP-β-CD溶液中,磁力攪拌3 d。將攪拌均勻的混合液旋蒸去除有機溶劑后,用0.45 μm過濾膜濾出不溶物,剩余濾液經(jīng)冷凍干燥后即得桑色素/HP-β-CD包合物。

1.2.1.2桑色素/HP-β-CD物理混合物的制備25 ℃的條件下,將桑色素與HP-β-CD按摩爾比1∶1稱取,放入研缽中充分研磨均勻后的產(chǎn)物為桑色素/HP-β-CD的物理混合物。

1.2.2分析方法

1.2.2.1桑色素的標準曲線配制1×10-3mol/L的桑色素乙醇溶液,再稀釋成濃度梯度從2.0×10-5～3.0×10-5mol/L的標準液,檢測其吸光值。然后以桑色素的濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制桑色素濃度與吸光值的標準曲線,得標準曲線為y=18.458x-0.1061,R2=0.9995,線性相關(guān)性好。

1.2.2.2桑色素包合物的相溶解度將10 mg桑色素加入10 mL不同濃度的HP-β-CD溶液中(濃度從0 mol/L到1.0×10-2mol/L),放入25 ℃的水浴鍋中強力振蕩24 h,使用0.45 μm過濾膜除去不溶物,利用分光光度計檢測濾液的吸光值,代入到標準曲線中。以HP-β-CD的濃度為橫坐標,桑色素的溶解度為縱坐標,繪制桑色素的相溶解度曲線。桑色素與HP-β-CD的締合常數(shù)根據(jù)所得的相溶解曲線按下列公式計算得到[13]:

式(1)

式中,S0表示在25 ℃的條件下,不添加環(huán)糊精的桑色素的溶解度;Slope為相溶解度曲線的斜率。

1.2.2.3掃描電子顯微鏡(SEM)將桑色素、HP-β-CD、桑色素/HP-β-CD混合物和桑色素/HP-β-CD包合物粉末研磨均勻后,在雙面導電膠帶上涂布薄薄的一層,放入噴金室噴金30 s,使樣品具有導電性,之后將處理好的樣品放入電鏡中觀察形貌。

1.2.2.4X-射線粉末衍射(XRD)在檢測條件為Cu Ka射線,波長=1.54056 ?,電壓40 kV,電流40 mA,掃描速度4°/min,2θ范圍5～50°的情況下,對桑色素、HP-β-CD、桑色素/HP-β-CD物理混合物及桑色素/HP-β-CD包合物進行X-射線粉末衍射實驗,檢測物質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。

1.2.2.5差示掃描量熱法(DSC)及熱重分析(TG)差示掃描量熱分析及熱重分析實驗操作條件為:升溫區(qū)間為50～500 ℃,升溫速率10 ℃/min,氮氣流量70 mL/min。

1.2.2.6光穩(wěn)定性研究使用波長范圍在UVB區(qū)間內(nèi)的紫外燈照內(nèi)含桑色素濃度為7×10-5mol/L的桑色素及其包合物溶液,利用紫外-可見分光光度計檢測300～500 nm內(nèi)物質(zhì)的吸光值。物質(zhì)光解剩余量的表達方式是:經(jīng)紫外光照射后物質(zhì)的吸光度占未經(jīng)紫外照射時的百分比,其計算公式如下[14]:

光穩(wěn)定性(%)=經(jīng)紫外照射樣品時的吸光度/未經(jīng)紫外照射樣品的吸光度×100

式(2)

2　結(jié)果與討論

2.1相溶解度

利用相溶解度法分析了25 ℃水浴條件下,桑色素與HP-β-CD之間的相互作用,得到其相溶解度曲線如圖所示(圖1)。圖像中的曲線為典型的AL型相溶解度曲線,表明了桑色素與HP-β-CD之間形成了摩爾比1∶1的包合物[15],意味著一個桑色素分子僅與一個HP-β-CD分子產(chǎn)生包合作用。

通過相溶解度曲線的斜率可以計算得到主客體間形成包合物的締合常數(shù)值,該數(shù)值越大,表明主客體之間的包合能力越強[16]。實驗得出:桑色素/HP-β-CD包合物的締合常數(shù)為833(mol/L)-1,表明形成的包合物較為穩(wěn)定。此外,當加入HP-β-CD的濃度為8×10-3mol/L時,包合物的溶解度較未經(jīng)包合物質(zhì)溶解度提高了7倍,表示環(huán)糊精的包合作用有助于提高桑色素的水溶性。

圖1　HP-β-CD存在下桑色素的相溶解度曲線(25 ℃)Fig.1　Phase-solubility diagram of morinwith HP-β-CD(25 ℃)

2.2掃描電子顯微鏡(SEM)

圖3　XRPD圖(a)桑色素,(b)HP-β-CD,(c)HP-β-CD與桑色素的物理混合物,(d)桑色素/HP-β-CD包合物Fig.3　XRPD patterns:(a)morin,(b)HP-β-CD,(c)morin and HP-β-CD physical mixture,(d)morin/HP-β-CD inclusion complex

桑色素、HP-β-CD、桑色素/HP-β-CD物理混合物和桑色素/HP-β-CD包合物的掃描電子顯微照片如圖2所示。其中,桑色素的晶型為表面粗糙的塊狀晶體,而HP-β-CD為不規(guī)則球形。在兩者的物理混合物中,桑色素的晶體形狀及HP-β-CD的形狀同時存在。對比包合物,其掃描圖片中未出現(xiàn)桑色素及HP-β-CD的形狀,而是出現(xiàn)了表面光滑的塊狀結(jié)構(gòu)。該對照結(jié)果表明:桑色素與HP-β-CD簡單的物理混合并未使兩者發(fā)生相互作用,兩者仍以原始的狀態(tài)存在。而通過冷凍-干燥法獲得的包合物,桑色素與HP-β-CD的特征形態(tài)均消失,推測兩者可能發(fā)生了相互作用,制備的包合物不再以晶體的形態(tài)存在。

圖2　SEM圖(a)桑色素,(b)HP-β-CD,(c)HP-β-CD與桑色素的物理混合物,(d)桑色素/HP-β-CD包合物(1000×)Fig.2　Scanning electron microphotographs:(a)morin,(b)HP-β-CD,(c)morin and HP-β-CD physical mixture,(d)morin/HP-β-CD inclusion complex(1000×)

2.3X-射線粉末衍射(XRD)

為了進一步的證明桑色素/HP-β-CD包合物的形成,選用XRD對桑色素及其包合物進行分析,結(jié)果見圖3。HP-β-CD的粉末衍射峰為兩條寬峰,表示其為非晶體結(jié)構(gòu),而桑色素的特征衍射峰中則出現(xiàn)了許多晶體結(jié)構(gòu)特有的尖峰。物理混合物的峰型為兩者峰型的簡單疊加,證明它們并未形成化學鍵,仍保留著各自的物理特性。對比包合物的XRD模型,其峰型與HP-β-CD的幾乎一樣,原有的晶體特征峰完全消失。該結(jié)果證明了桑色素形成包合物后失去了原有的晶體結(jié)構(gòu),也驗證了對SEM實驗結(jié)果的推測。

2.4差示掃描量熱分析(DSC)及熱重分析(TG)

圖4為桑色素(圖4a),HP-β-CD(圖4b),桑色素/HP-β-CD混合物(圖4c),桑色素/HP-β-CD包合物(圖4d)的DSC曲線。由于桑色素特殊的晶體結(jié)構(gòu),使得它存在兩條較寬的熱分解峰,一個在294 ℃,另一個在352 ℃。HP-β-CD僅存在一個熱分解峰,發(fā)生在357 ℃。桑色素/HP-β-CD包合物的譜圖中,其熱分解峰僅有一個,為341 ℃。桑色素及HP-β-CD的吸收峰完全消失,表明主客體之間形成了交聯(lián)結(jié)構(gòu),并且熱分解溫度也趨于穩(wěn)定且有所提升,意味著包合后的桑色素熱穩(wěn)定性得到了加強。桑色素/HP-β-CD物理混合物的DSC譜圖應為兩者譜圖的簡單疊加,造成桑色素/HP-β-CD的物理混合物與其包合物DSC圖類似的原因可能是桑色素在物理混合物中所占比例小且桑色素在發(fā)生熔融分解時,其中一部分與HP-β-CD形成了包合物的結(jié)果。

圖4　DSC圖(a)桑色素,(b)HP-β-CD,(c)HP-β-CD與桑色素的物理混合物,(d)桑色素/HP-β-CD包合物Fig.4　DSC thermograms:(a)morin,(b)HP-β-CD,(c)morin and HP-β-CD physical mixture,(d)morin/HP-β-CD inclusion complex

圖5　TG圖(a)桑色素,(b)HP-β-CD,(c)HP-β-CD與桑色素的物理混合物,(d)桑色素/HP-β-CD包合物Fig.5　TG curves(a)morin,(b)HP-β-CD,(c)morin and HP-β-CD physical mixture,(d)morin/HP-β-CD inclusion complex

熱重分析與差示掃描量熱分析的原理類似,也是研究包合物熱穩(wěn)定性的有效方法。根據(jù)桑色素(圖5a)、HP-β-CD(圖5b)、HP-β-CD/桑色素物理混合物(圖5c)及桑色素/HP-β-CD包合物(圖5d)的熱重分析圖像可知(見圖5):桑色素質(zhì)量在251 ℃時出現(xiàn)了下降趨勢,表示該溫度下,桑色素發(fā)生了分解。而HP-β-CD和桑色素/HP-β-CD包合物的分解溫度分別為341、273 ℃,包合物的分解溫度與主客體物質(zhì)均不相同,以此證明了桑色素與HP-β-CD發(fā)生相互作用。而兩者的物理混合物及包合物TG圖相差不大的原因與DSC圖類似。

2.5光穩(wěn)定性

圖6　桑色素隨光照時間的紫外-可見光譜圖Fig.6　The UV-Vis spectra of morinwiththe photoirradiation

圖7　桑色素/HP-β-CD包合物隨光照時間的紫外-可見光譜圖Fig.7　The UV-Vis spectra of morin/HP-β-CDwiththe photoirradiation

為了研究HP-β-CD對桑色素光降解的保護作用,分別配制了相同濃度的桑色素及其包合物溶液,將其置于黑暗環(huán)境中,用紫外光照射,每隔一段時間檢測吸光度的變化,其結(jié)果如圖6、圖7。由圖6、圖7可知,桑色素及其包合物的最大吸收波長由359 nm逐漸紅移至362 nm,推測是由于生色團的共軛鍵被破壞,產(chǎn)生了光解產(chǎn)物。根據(jù)圖8可以看出:隨著紫外刺激的時間增加,桑色素及其包合物的吸光值隨之減小,表明桑色素發(fā)生了光解反應,但是桑色素/HP-β-CD包合物吸光值的下降趨勢要小于桑色素。從圖9中可知:紫外照射300 min后,桑色素/HP-β-CD包合物光解剩余量為82.7%,而桑色素僅為75.2%,由此證明了桑色素/HP-β-CD包合物的光穩(wěn)定性要大于桑色素。

圖8　桑色素和桑色素/HP-β-CD在最大吸收波長處隨光照時間的變化圖Fig.8　The absorbance of morin and morin/HP-β-CDat max absorption wavelengh with the photoirradiation time

圖9　桑色素和桑色素/HP-β-CD包合物在最大收波長處隨光照時間的剩余量Fig.9　The remnant of morin and morin/HP-β-CDat max absorption wavelengh with the photoirradiation time

桑色素發(fā)生光降解的原因可能是由于受UVB光照刺激,自身被光氧化導致結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果[16-17]。CD因能提供更多的非極性環(huán)境、阻斷通往客體分子的光路而具有保護客體分子免受可見光及紫外光刺激的作用[18]。根據(jù)黃酮類化合物的特點,其光穩(wěn)定的強弱主要取決于苯環(huán)上的羥基(-OH)[19],由于包合物也產(chǎn)生部分光解,推測原因可能為桑色素的酚羥基并未完全被HP-β-CD包合,部分處在空腔的外部,從而未能100%的起到光保護作用。

3　結(jié)論

采用冷凍-干燥法制備了桑色素/HP-β-CD包合物,桑色素的水溶性經(jīng)HP-β-CD包合后得到了大幅增長,包合物水溶性增強的原因可能是由于環(huán)糊精將桑色素難溶于水的部分全部包裹在疏水性空腔內(nèi)部,從而大大增加了其在水中的溶解性。此外,SEM、XRD的研究證明了桑色素與HP-β-CD包合成功,DSC及TG實驗分析得出桑色素包合物的熱穩(wěn)定性要高于未包合的桑色素,而紫外光照實驗則證實了CD可以有效地保護空腔內(nèi)的桑色素免受外界環(huán)境的干擾。因此,桑色素/HP-β-CD包合物可以作為水溶性色素添加到糕點、飲料等食品行業(yè)中。而且由于各方面穩(wěn)定性能的提升也有助于食品的儲存、運輸。總之,桑色素/HP-β-CD包合物穩(wěn)定性的研究為其在食品工業(yè)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。

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Preparation and stability of the inclusion complex of HP-β-CD with morin

LI Shu-jing,ZHOU Zi-ruo,ZHOU Wei,BAI Dong-sheng

(Department of Chemistry,School of Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The water-soluble inclusion complex of morin and(2-hydroxy)propyl-β-cyclodextrin(HP-β-CD)was prepared by freeze-drying method. The effects of the inclusion behavior of host-guest was investigated by methods of phase-solubility and characterized byscanning electron microscopy(SEM)and X-ray diffraction(XRD).Furthermore,the stability of morin and it inclusion complex was also investigated by differential scanning calorimetry(DSC),andphotostability test.The experiment showed thatmorin formed 1∶1 stoichiometric inclusion complex with HP-β-CD,and the apparent stability constant was 833(mol/L)-1.The solubility of the morin was dramaticallyincreasedas it enhanced more than 9 times. Also the decomposition temperature of morin was improved from 294 ℃ to 341 ℃ after encapsulated by HP-β-CD and the photostability of morin was enhanced from 75.2% to 82.7%. Therefore,it could be a potentially promising way to promote its stability as food additive in storage and application.

morin;cyclodextrin;inclusion complex;solubility;photodegradation

2016-03-23

李姝靜(1980-), 女, 博士, 副教授, 主要從事新型主客體識別功能體系的設(shè)計與制備方面的研究,E-mail:lishujing@mail.ipc.ac.cn。

國家自然科學基金(31501445)；北京工商大學中國化妝品協(xié)同創(chuàng)新研究中心。

TS201.1

A

1002-0306(2016)18-0094-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.010