王　京,鐘世歡,王慶齡,陳青俊,周　兵

(浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司,浙江杭州 310009)

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蜂花粉中黃酮類化合物的鑒定和含量測(cè)定

王京,鐘世歡,王慶齡,陳青俊,周兵

(浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司,浙江杭州 310009)

以24種不同蜂花粉為材料,對(duì)其中微量特征成分黃酮類化合物進(jìn)行鑒定和歸納。建立一種高壓液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法快速測(cè)定蜂花粉中8種黃酮類化合物的方法。破壁的試樣經(jīng)乙醇溶液提取后加酸水解,經(jīng)反相色譜分離,質(zhì)譜定性并測(cè)定8種黃酮類化合物含量,外標(biāo)法定量。該方法線性良好,R2均大于0.999,檢出限為0.15～3.0 mg/kg,精密度為3.2%～6.6%,回收率在91.2%～100.2%,此方法操作簡(jiǎn)便,抗基質(zhì)干擾、結(jié)果可靠。分析結(jié)果證實(shí),蜂花粉中黃酮類化合物通常有槲皮素、山奈酚、蘆丁等?？蔀樽R(shí)別蜂花粉的植物來源,鑒別真?zhèn)魏徒⑾鄳?yīng)的指紋圖譜提供研究方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蜂花粉,黃酮,指紋圖譜,LC-MS/MS

目前在淳于自然的營(yíng)養(yǎng)保健品中,蜂花粉受到越來越多人的青睞。蜂花粉源自花蕊中的花粉粒,號(hào)稱“微型營(yíng)養(yǎng)庫”[1]?；ǚ劬哂胸S富氨基酸、糖類、脂類、黃酮類、皂苷、甾體、萜類化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),具有抑菌、抗疲勞、降血脂、抗氧化等醫(yī)療保健作用[2-3]。其中蜂花粉豐富的黃酮類物質(zhì)因其具有抗氧化、消除自由基作用[4],更是成為研究的熱點(diǎn)。目前提取花粉中黃酮類物質(zhì)的方法主要有熱回流法、微波法、萃取法、超聲法、酶解法、溫差法、溫差-超聲法、溫差-酶法及超聲-微波協(xié)同萃取法等[5-7]。測(cè)定黃酮含量的方法有比色法[8],分光光度法[9],反相高效液相色譜法[10],HPLC-DAD及HPLC-MS法等[11-14];但是這些方法和研究存在檢測(cè)靈敏度不高,前處理繁瑣及重現(xiàn)性不佳,定性不準(zhǔn)確,樣本數(shù)量欠缺等不足。隨著蜂花粉市場(chǎng)需求的擴(kuò)大,一些不良商家造假摻假等問題日益嚴(yán)重;隨著從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,也為蜂產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定提供了可能。本研究通過優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件、預(yù)處理方法,最終建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法快速測(cè)定蜂花粉中8種黃酮類化合物的方法;并且以24種不同蜂花粉為材料,對(duì)其中微量特征成分黃酮類化合物進(jìn)行鑒定和歸納,為鑒別蜂花粉的植物來源和地源屬性提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，美國(guó)TEDIA公司;氫氧化鉀、無水乙醇、鹽酸均為優(yōu)級(jí)純，上海譜振生物科技有限公司;1∶1氫氧化鉀溶液(100 g氫氧化鉀用100 mL水溶解混勻);楊梅素、山奈酚、槲皮素、高良姜素、芹菜素、喬松素、楊梅素、白楊素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度≥98%。

Agilent 1200超高效液相色譜儀串聯(lián)6430三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)Agilent公司;Eppendorf Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司;AS 3120超聲波振蕩器天津特賽恩斯儀器有限公司;Millipore-iQ高純水凈化儀美國(guó)Millipore公司;DFY-500 搖擺高速中藥粉碎機(jī)中國(guó)精勝科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理

1.2.1.1超聲提取法準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確到0.1 mg)蜂花粉試樣,加入40 mL 80%乙醇以53 KHz頻率超聲提取15 min,4000 r/min離心5 min后轉(zhuǎn)移上清液;重復(fù)提取一次后合并清液用乙醇定容至100 mL,用0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.1.2溫差-超聲提取法準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確到0.1 mg)蜂花粉試樣,加入50 mL 80%乙醇以53 KHz頻率超聲提取15 min,于-18 ℃冷凍過夜后取出立即放入100 ℃水浴,放冷用乙醇定容至100 mL,4000 r/min離心5 min后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.1.3溫差-酸水解法準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確到0.1 mg)蜂花粉試樣,加入50 mL 80%乙醇以53 KHz頻率超聲提取15 min,于-18 ℃冷凍過夜后取出立即放入100 ℃水浴,加入2.0 mL鹽酸,用80%的乙醇定容至100 mL后轉(zhuǎn)移至平底燒瓶,稱重后70 ℃水浴水解1 h,放冷后用KOH溶液調(diào)pH至中性后用80%乙醇溶液補(bǔ)足重量,4000 r/min離心5 min后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.2色譜參考條件色譜柱:Angilent SB-C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。流動(dòng)相:A:0.2%甲酸水溶液,B:0.2%甲酸乙腈溶液。流速:0.3 mL/min。梯度洗脫:0～3 min,10% B～15% B;3～5 min,15% B～20% B;5～7 min,20% B～40% B;7～9 min,40% B～65% B;9～11 min,65% B～80% B;11～12 min,80% B～90% B;12～13 min,90% B～90% B;13～14 min,90% B～10% B。柱溫:30 ℃。進(jìn)樣量:2 μL。

1.2.3質(zhì)譜條件離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子模式;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:9 L/min;霧化氣壓力:45 psi;毛細(xì)管電壓:+4000 V。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

選取甲醇、乙腈、甲醇和乙腈的混合溶液作為有機(jī)相,考察了流動(dòng)相對(duì)色譜分離度和靈敏度的影響。結(jié)果表明:從靈敏度上看,乙腈>甲醇乙腈混合液>甲醇;乙腈作為流動(dòng)相時(shí)各目標(biāo)物出峰時(shí)間雖然更早但是分離度更好,峰強(qiáng)度增大,峰形尖銳。正離子模式下加入一定量的甲酸可以增強(qiáng)離子化效率,經(jīng)比較0.1%、0.2%、0.3%的甲酸濃度對(duì)峰形和靈敏度的影響,結(jié)果顯示當(dāng)甲酸濃度在0.1%～0.2%的范圍內(nèi)隨濃度增加靈敏度增強(qiáng),超過0.2%時(shí)多數(shù)目標(biāo)物靈敏度下降明顯,故選擇0.2%作為甲酸添加量。同時(shí)為保證梯度洗脫的穩(wěn)定性,在乙腈中也加入0.2%的甲酸。最終確定0.2%甲酸水溶液～0.2%甲酸乙腈溶液梯度洗脫的流動(dòng)相體系。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中含有羰基等多電子基團(tuán),易于ESI源的正離子模式下形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子,采用三通方式在ESI+模式下分別對(duì)8種黃酮類化合物的單標(biāo)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析,確定準(zhǔn)分子離子峰,再使用子離子掃描模式,選擇豐度合適的定量和定性子離子。同時(shí)對(duì)碰撞能和裂解電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最終確定的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　質(zhì)譜參數(shù)表

8種黃酮類化合物的MRM色譜圖見圖1,其中a～h依次為蘆丁、楊梅素、槲皮素、山奈酚、芹菜素、高良姜素、喬松素和白楊素。

圖1　8種黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1　The MRM chromatogram for 8 flavonoids

2.3提取方式的優(yōu)化

由于植物細(xì)胞壁對(duì)目標(biāo)物的提取會(huì)有很大的影響,以粉碎機(jī)預(yù)破壁后的獼猴桃蜂花粉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,考察直接超聲提取、溫差法破壁后酸水解、溫差法破壁后超聲提取三種提取方式對(duì)楊梅素含量、山奈酚的影響,結(jié)果見圖2。

圖3　8種黃酮類化合物碎裂方式Fig.3　The fragmentation modes for 8 kinds of flavonoids

圖2　三種提取方式的比較Fig.2　The comparison of 3 kinds of extraction

由圖2可知,溫差-酸水解法得率最高,可能是由于酸水解可以破壞植物細(xì)胞壁并將各種結(jié)合態(tài)的黃酮苷轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的黃酮苷元,故選擇溫差-酸水解法作為本實(shí)驗(yàn)提取方式。

2.4黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

由ESI+MS2圖譜可知,8種黃酮類物質(zhì)具有共同的特征碎片離子m/z 153,可以推測(cè)其斷裂方式如圖3。

可見黃酮類化合物具有相似的質(zhì)譜行為,其分子離子化后產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子[M+H]+均以如圖4所示斷裂。

圖4　二級(jí)質(zhì)譜下黃酮類化合物的普遍碎裂方式Fig.4　The common fragmentation modesfor flavonoids on tandem mass spectrometry

結(jié)合文獻(xiàn)資料的分析,m/z 153是黃酮母體結(jié)構(gòu)在C環(huán)發(fā)生RDA反應(yīng)的結(jié)果。通過對(duì)24種不同蜜源或地緣的蜂花粉的ESI+SCAN分析發(fā)現(xiàn)蜂花粉提取物在一級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)產(chǎn)生的主要特征碎片有m/z 104、255、257、271、287、303、319、380、438、611、622、663等,可以推測(cè)其主要是一些多酚類、黃酮類物質(zhì)。

2.5不同來源蜂花粉中黃酮種類定性分析

通過對(duì)24種不同蜜源或地源屬性的蜂花粉中8種黃酮化合物ESI+MRM定性分析,結(jié)果見表2。

表2　蜂花粉中黃酮種類定性分析表

注:√表示檢出。

由表2可知,不同蜜源的蜂花粉之間黃酮類物質(zhì)種類差異明顯,同蜜源不同地緣的蜂花粉中荷花、蕓芥花、蕎麥花等黃酮種類接近,而葵花、油菜花等黃酮種類差異也較大。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)酸水解后能從葡萄糖苷鍵鍵合的黃酮苷中釋放出黃酮苷元,如油菜蜂花粉經(jīng)溶劑提取后直接測(cè)定未測(cè)得山奈酚而經(jīng)酸水解后可得,可能是由于其天然狀態(tài)下以山奈酚-3,4′-雙-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的形式存在于油菜蜂花粉中,因此要準(zhǔn)確測(cè)定含量須經(jīng)酸水解將結(jié)合態(tài)的黃酮轉(zhuǎn)化為黃酮本體。

表3　標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性參數(shù)表

注:a代表本方法,b代表GB/T 19427-2003。

2.6指紋圖譜的建立

取24種不同蜂花粉,在ESI+SCAN條件下進(jìn)行指紋圖譜分析并記錄色譜圖,結(jié)果顯示不同植物來源的蜂花粉之間并無明顯聯(lián)系,而同源的蜂花粉可以建立相應(yīng)的指紋圖譜。本實(shí)驗(yàn)選取4種油菜花蜂花粉建立指紋圖譜,可用于鑒定油菜蜂花粉的植物來源,結(jié)果如圖5。

2.7線性關(guān)系和檢測(cè)限

將標(biāo)準(zhǔn)工作液按濃度由低到高進(jìn)樣,在1.2中所述儀器條件下測(cè)定,分別以黃酮類化合物的濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并回歸得到線性方程。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性參數(shù)見表3。

由表3可知,8種黃酮類化合物在各自標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)線性良好,靈敏度足夠進(jìn)行蜂花粉中黃酮類化合物的鑒別和含量測(cè)定。

2.8精密度和回收率

對(duì)3種不同種類蜂花粉分別進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),考察精密度和回收率,結(jié)果見表4。

由表4可知,8種黃酮類化合物加標(biāo)樣品平均回收率在91.2%～100.2%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%

表4回收率實(shí)驗(yàn)表(n=6)

Table 4The experiment list for recovery(n=6)

化合物添加量(mg/kg)油菜花蜂花粉荷花蜂花粉茶花蜂花粉回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)回收率(%)RSD(%)楊梅素38.295.96.193.85.2100.26.5槲皮素10.192.83.293.74.196.35.9蘆丁10.292.56.691.35.396.95.5芹菜素4.8591.23.693.34.795.46.3松屬素4.7095.14.294.93.992.95.5高良姜素1.9093.43.794.53.991.96.1白楊素1.9794.44.791.54.993.95.1山奈酚4.3195.43.992.55.192.34.3

圖5　油菜蜂花粉指紋圖譜Fig.5　The fingerprint of rape pollen注:1～4分別為表2中的油菜蜂花粉1,油菜蜂花粉2,油菜蜂花粉3,油菜蜂花粉4。

～6.6%,本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3　結(jié)論

粉碎后的試樣經(jīng)溫差法破壁,乙醇溶液提取后加酸水解,后用甲醇溶液稀釋,經(jīng)反相色譜分離,質(zhì)譜定性并測(cè)定黃酮苷元含量,外標(biāo)法定量。該方法線性良好,檢出限為0.15～3.0 mg/kg,精密度為3.2%～6.6%,回收率在91.2%～100.2%,此方法操作簡(jiǎn)便,抗基質(zhì)干擾、結(jié)果可靠,適合蜂花粉中常見黃酮類物質(zhì)的含量的準(zhǔn)確測(cè)定。經(jīng)MS分析后歸納,不同來源蜂花粉中黃酮主要以槲皮素、山奈酚、蘆丁等形式存在,根據(jù)蜜源不同還有以高良姜素、芹菜素等特征形式存在的黃酮類化合物,同蜜源不同地的蜂花粉也存在一些差別。本研究通過對(duì)黃酮結(jié)構(gòu)和蜂花粉提取物的質(zhì)譜分析,也為建立蜂花粉中黃酮類物質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行其植物源的真實(shí)屬性判定提供了研究方法和依據(jù)。

[1]英華,胡富良.我國(guó)花粉化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].養(yǎng)蜂科

技,2005(4):7-16.

[2]王丹丹,耿越.花粉活性天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)蜂業(yè),2015,66(5):20-24.

[3]張紅城,董捷.六種蜂花粉多酚和黃酮類物質(zhì)含量測(cè)定及抗氧化性的研究[J].食品科技,2007,28(9):500-502.

[4]Pier-Giorgio Pietta. Flavonoids as Antioxidants[J].J Nat Prod,2000,63(7):1035-1042.

[5]阮征,鄧澤元.HPLC法測(cè)定油菜蜂花粉中黃酮含量及六種破壁方法對(duì)黃酮提取的影響[J].食品科學(xué),2008,29(10):455-458.

[6]王洪倫,索有瑞,王小艷,等.油萊蜂花粉中黃酮類物質(zhì)的超聲波提取工藝:中國(guó),CN200810017961.8[P].2009-10-14.

[7]汪河濱,郭志愿,趙小亮,等.超聲-微波協(xié)同萃取灰葉胡楊花粉中總黃酮的工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(2):61-64.

[8]馬陶陶,張群林,李俊,等.三氯化鋁比色法測(cè)定中藥總黃酮方法的探討[J].時(shí)珍國(guó)國(guó)藥,2008,19(1):54-56.

[9]林偉宣,孫學(xué)謙.紫外分光光度法測(cè)定山楂中總黃酮的研究[J].大連輕工業(yè)學(xué)院,1993,12(2):50-54.

[10]張延之,侯靜德.反相高效液相色譜法測(cè)定毛竹葉中總黃酮[J].理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè),2001,37(3):117-118.

[11]鄭敏燕,魏永生.油菜蜂花粉含量的 HPLC測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2004,21(2):95-97.

[12]楊潔,陳純,邢建軍.油菜蜂花粉中黃酮類化合物的提取與鑒定[J].食品科學(xué),2010,31(22):273-278.

[13]A Hasler,O Sticher,B Meier.Identification and determination of the flavonoids from Ginkgo biloba by high-performance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A,1992,605(1):41-48.

[14]Bonvehi JS,Torrento MS. Evaluation of polyphenolic and flavonoid compounds in honeybee-collected pollen produced in spain[J]. Agricultural and Food Chemistry,2001,49:1848-1853.

Identification and detection of flavonoids in bee pollen

WANG Jing,ZHONG Shi-huan,WANG Qing-ling,CHEN Qing-jun,ZHOU Bing

(Zhejiang Gongzheng Inspection Center Co.,Ltd.,Hangzhou 310009,China)

To establish a quick,accurate and sensitive approach to analyse flavonoid contents using 24 kinds of bee pollen as material,a method called ultra-high pressure liquid chromatograph with tandem triple level 4 pole mass spectrometry had been set up in this research,aimed to detect 8 types of flavone. After crushed the wall of samples by temperature,differential method stepped by the acid hydrolysis through ethanol extraction and finally diluted with methanol solution,the targets aimed to detect were seperated by reversed-phase chromatography,measured by mass spectrometry and quantitated by external standard method. Statistics indicated that this method had a good linear withR2>0.999,its RSD was less than 6.6 percent and more than 3.2 percent. The LOD was between 0.15 and 3.0 mg/kg along with a hight recovery rate ranged from 91.2% to 100.2%. Depended on its easier operation,reliable result with lower matrix interference,this method could be applied to other flavonoids contents in bee pollen such as quercetin,kaempferol,rutin and so on. Last but not the least,it could also provide experimental bases and research methodology to identify the plant origin for bee pollen,distinguish authenticity further to build revelant fingerprint.

bee pollen;flavone;fingerprint;LC-MS/MS

2016-03-11

王京(1987-),男,在職碩士研究生,工程師,研究方向:食品檢測(cè)技術(shù)開發(fā)與食品安全,E-mail:178058645@qq.com。

贊宇科研基金資助項(xiàng)目。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0085-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.008