劉　娜,趙　新,陳　銳,王　成,朱　珠,王　永,蘭青闊

(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,天津 300381)

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動(dòng)物肌肉組織DNA的提取方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

劉娜,趙新+,陳銳,王成,朱珠,王永,蘭青闊*

(天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,天津 300381)

以生鮮羊肉、豬肉、雞肉、牛肉、鴨肉為實(shí)驗(yàn)材料,采用SDS法、異硫氰酸胍法、試劑盒法提取動(dòng)物肌肉組織基因組DNA,對提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明,試劑盒法提取的基因組DNA在濃度和純度方面均優(yōu)于SDS法和異硫氰酸胍法。通過對三種提取方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,回歸系數(shù)(R2)按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒法≥異硫氰酸胍法>SDS法,擴(kuò)增效率按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒法>異硫氰酸胍法>SDS法。三種提取方法的羊源性成分靈敏度檢測,最低檢出限均為80 pg/μL,但在低濃度檢測時(shí)試劑盒法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.684%,小于異硫氰酸胍法0.734%和SDS法1.075%;豬源性成分靈敏度檢測,SDS法的最低檢出限為80 pg/μL,異硫氰酸胍法和試劑盒法的最低檢出限均為16 pg/μL,但在低濃度檢測時(shí)試劑盒法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.092%,小于異硫氰酸胍法4.640%;雞源性成分靈敏度檢測,SDS法和異硫氰酸胍法的最低檢出限均為3.2 pg/μL,試劑盒法的最低檢出限為640 fg/μL,明顯高于SDS法和異硫氰酸胍法。綜上所述,試劑盒法提取的基因組DNA更有利于運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行食物摻假和物種鑒別工作。

動(dòng)物肌肉,SDS法,異硫氰酸胍法,試劑盒法,DNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR

近年來,隨著食品工業(yè)的迅猛發(fā)展,動(dòng)物源食品摻假造假現(xiàn)象普遍發(fā)生,對食品進(jìn)行動(dòng)物源成分鑒定,已經(jīng)成為一個(gè)備受關(guān)注的問題[1-2]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子學(xué)鑒定方法成為研究的熱點(diǎn)。由于PCR方法特異性和靈敏度都很高,以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于鑒定食品、飼料中的動(dòng)物源性成分,而高質(zhì)量、高純度的基因組DNA的獲得則是開展該方面研究工作的前提。長期以來,動(dòng)物肌肉組織樣本中DNA的提取一直是耗時(shí)、繁瑣的過程,消解過程長達(dá)數(shù)小時(shí)甚至過夜,嚴(yán)重減慢了檢測速度,同時(shí)在提取過程中還反復(fù)使用多種有機(jī)溶劑,對實(shí)驗(yàn)人員的健康造成損傷。因此,許多學(xué)者一直在探索動(dòng)物肌肉組織DNA的高效安全提取方法。

表1　PCR和測序引物序列

目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)并使用的動(dòng)物肌肉組織DNA提取方法有很多,其中使用最頻繁主要為SDS法、異硫氰酸胍法[3]、試劑盒法[4],以及一些以SDS法為基礎(chǔ)的改良方法[5]。根據(jù)研究表明,SDS法雖能獲得純度高,含量多的DNA,但比較費(fèi)時(shí),往往消化過程需要數(shù)小時(shí)甚至過夜,且蛋白酶K的消化成本過高,流程繁瑣,操作復(fù)雜,而且提取過程中使用了大量的有機(jī)溶劑,有損實(shí)驗(yàn)人員的健康。異硫氰酸胍法操作相對簡單、快速,雖可以得到較純的DNA,但仍不可避免氯仿等有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)人員的損傷。本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)各種方法的原理和試劑特性,開發(fā)出一種便于提取DNA的試劑盒。該試劑盒將SDS(十二烷基硫酸鈉)與吸附性硅膠柱相結(jié)合,既達(dá)到了有效的細(xì)胞裂解,又通過硅膠柱實(shí)現(xiàn)了安全無污染的分離純化,同時(shí)操作簡單、快速且成本低廉,有效地避免使用氯仿等有機(jī)溶劑,并對操作人員沒有損害。

因此本文采用SDS法、異硫氰酸胍法以及本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒法提取不同動(dòng)物肌肉組織基因組DNA,并對提取的DNA進(jìn)行純度、濃度檢測和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析,從而對提取效果進(jìn)行比較,為食品安全中利用PCR技術(shù)進(jìn)行食物摻假和物種鑒別檢測提供一個(gè)更快速、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

生鮮羊肉、生鮮豬肉、生鮮雞肉、生鮮牛肉、生鮮鴨肉均購于天津市農(nóng)貿(mào)市場;DNA提取主要試劑的配制:SDS裂解液10 mol/L NaOH、500 mmol/L EDTA、1 mol/L Tris·Cl、5 mol/L NaCl、10%十二烷基磺酸鈉;異硫氰酸胍裂解液5 mol/L GuSCN、50 mmol/L Tris·Cl、20 mmol/L EDTA、1.3%Triton-100 曲拉通;TE緩沖液10 mmol/L Tris·HC1、l rnmol/L EDTA;三氯甲烷-異戊醇比例為24∶1;異丙醇、70%乙醇;實(shí)驗(yàn)用水滅菌雙蒸水;定量Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液TaKaRa公司;引物、探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

StepOnePlus Real-time PCR儀美國ABI公司;SUB-cell GT核酸電泳儀、ND-1000 NanoDrop核酸蛋白測定儀美國Bio-Rad公司;G:BOX凝膠成像系統(tǒng)英國SYNGENE公司;Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)美國BECKMAN公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物與探針的設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6],同時(shí)根據(jù)GenBank中公布的動(dòng)物源線粒體細(xì)胞色素b基因序列,運(yùn)用Primer Express 3.0軟件,設(shè)計(jì)引物和探針序列,見表1,引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2樣品的制備取待測動(dòng)物肌肉組織樣本清水洗凈后,剔去動(dòng)物組織中的結(jié)締組織和脂肪,剪成約200 mg的小塊,放入用液氮預(yù)冷的研缽中,然后緩緩的向研缽中加入液氮,迅速研磨,直到樣品成細(xì)微的粉末狀為止。本實(shí)驗(yàn)涉及的羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、牛肉可分為三類,一是反芻動(dòng)物包括羊和牛,二是禽源性動(dòng)物包括雞和鴨,三是豬。為了在較短時(shí)間內(nèi)比較三種DNA提取方法的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測效果,因此本實(shí)驗(yàn)室以羊肉、豬肉和雞肉為例,按照質(zhì)量濃度,以非目標(biāo)動(dòng)物源成分為基質(zhì),配制羊肉、豬肉、雞肉濃度含量為100%、50%、10%、5%、1%的標(biāo)準(zhǔn)品,備用。

1.2.3DNA模板的提取

1.2.3.1SDS法參照文獻(xiàn)[7]。取100 mg樣品至2 mL滅菌離心管中,加入500 μL SDS裂解液和20 μL蛋白酶K,混勻,55 ℃水浴消化數(shù)小時(shí)至過夜,期間不停顛倒混勻,直至溶液透明;將消化后的組織裂解液加入等體積的Tris飽和酚,緩慢顛倒混勻,12000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管中,重復(fù)1次;加入0.5倍體積的Tris飽和酚和0.5倍體積的氯仿/異戊醇(24∶1),緩慢顛倒混勻,12000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至一新離心管;加入0.1倍體積的乙酸鈉溶液和2.5倍體積4 ℃預(yù)冷的無水乙醇,緩慢顛倒混勻,可見白色DNA絮狀沉淀析出,-20 ℃沉淀2 h;12000 r/min離心5 min,加入500 μL 70%乙醇洗滌沉淀;室溫下放置使殘余乙醇完全揮發(fā),加入100 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀。

1.2.3.2異硫氰酸胍法參照文獻(xiàn)[8]。取50 mg粉末至2 mL滅菌離心管中,加入200 μL TE,混勻;再加入400 μL異硫氰酸胍裂解液和10 μL蛋白酶K,渦旋混勻,55 ℃水浴消化1 h,期間不停顛倒混勻,直至溶液透明;加入300 Tis-飽和酚和300 μL氯仿/異戊醇(24∶1),劇烈振蕩15 s,13000 r/min離心10 min;取上清,加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1),劇烈振蕩15 s,13000 r/min離心10 min;取上清,加入等體積的氯仿,劇烈振蕩15 s,13000 r/min離心10 min;取上清,加入0.8倍體積的異丙醇,12000 r/min離心10 min,棄上清,加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀;室溫下放置使殘余乙醇完全揮發(fā),加入100 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀。

1.2.3.3試劑盒法取100 mg放入2 mL離心管,加入500 μL SDS裂解液和6 μL蛋白酶K,65 ℃水浴60 min,期間不停顛倒混勻;13200 r/min離心5 min;小心地將上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中,加入0.8倍異丙醇;將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱中,13200 r/min,離心30 s,棄掉廢液;向吸附柱中加入70%乙醇,13200 r/min離心30 s,棄掉廢液,重復(fù)此步驟一次;將吸附柱放回收集管中,13200 r/min離心2 min,倒掉廢液;將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的乙醇;將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中,向吸附膜的中間位置懸空滴加100 μL的洗脫緩沖液TE,室溫放置2～5 min,13200 r/min,離心2 min,所得溶液即為DNA。

1.2.4DNA質(zhì)量檢測取2 μL DNA樣品溶液,用 Nano Drop ND1000進(jìn)行檢測和定量。同時(shí)取5 μL DNA溶液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析DNA的電泳情況。

1.2.5動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的建立PCR反應(yīng)體系為20 μL,各成分含量為:2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液10 μL,上下游引物各1 μL,探針引物0.5 μL,模板2 μL,無菌超純水補(bǔ)足20 μL,混勻后離心,在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上開始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為:95 ℃預(yù)變性15 min,然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)為95 ℃變性20 s,62 ℃退火30 s。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將配制的50%、10%、5%、1%的4個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品作為模版,建立20 μL反應(yīng)體系,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置3個(gè)平行,根據(jù)1.2.5建立的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

1.2.7方法靈敏度研究用鮭魚精DNA將提取的羊肉、豬肉、雞肉DNA原液稀釋至50 ng/μL,然后進(jìn)行5倍系列梯度稀釋,即50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2 pg/μL、640 fg/μL等8個(gè)梯度,去離子水作為陰性對照模版,以1.2.4建立的反應(yīng)程序及條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。RSD值按下列公式計(jì)算:

2　結(jié)果與分析

2.1DNA模版提取及濃度測定

DNA提取結(jié)果如表2所示,三種方法提取的DNA260/280比值均在1.8～2.0之間,提取方法對核酸中蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)的處理較為得當(dāng)。SDS法和試劑盒法提取的DNA 260/230比值在2.0以上,說明提取方法對核酸中鹽分等雜質(zhì)的處理較為得當(dāng);異硫氰酸胍法提取的DNA260/230比值在2.0以下,該提取方法對核酸中鹽分等雜質(zhì)處理的較差。同時(shí)用1%瓊脂糖電泳檢測核酸提取質(zhì)量,由圖1可知,異硫氰酸胍法、試劑盒法可得到相對單一條帶,但試劑盒法提取的DNA條帶更清晰明亮、整齊,蛋白質(zhì)和RNA污染少,相比SDS法提取的DNA條帶有拖尾現(xiàn)象,降解較為嚴(yán)重。

表2　不同肉源品種DNA濃度

圖1　不同肉源品種DNA電泳檢測Fig.1　DNA electrophoresis detection of different meat varieties注:M:DL2000 DNA Marker;1:異硫氰酸胍法-生鮮雞肉;2:異硫氰酸胍法-生鮮豬肉;3:異硫氰酸胍法-生鮮羊肉;4:異硫氰酸胍法-生鮮牛肉;5:異硫氰酸胍法-生鮮鴨肉;6:SDS法-生鮮雞肉;7:SDS法-生鮮豬肉;8:SDS法-生鮮羊肉;9:SDS法-生鮮牛肉;10:SDS法-生鮮鴨肉;11:試劑盒法-生鮮雞肉;12:試劑盒法-生鮮豬肉;13:試劑盒法-生鮮羊肉;14:試劑盒法-生鮮牛肉;15:試劑盒法-生鮮鴨肉。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本實(shí)驗(yàn)以生鮮羊肉、豬肉、雞肉為例建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過對不同肉源不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(50%、10%、5%、1%)進(jìn)行擴(kuò)增,每個(gè)梯度設(shè)三個(gè)重復(fù),選取重復(fù)性好的作為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn),以標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值(threshold cycle)為橫坐標(biāo)對初始濃度的對數(shù)值作圖,以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo),以測得的Ct值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南》要求,檢測方法的回歸系數(shù)R2最小可接受值0.98,斜率可接受的范圍:-3.1≥斜率≥-3.6,擴(kuò)增效率在90%～110%之間,所有質(zhì)量排序均參照《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南》要求以最接近100%為最優(yōu)。

對于生鮮羊肉,結(jié)果如表3所示,通過三種提取方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較,回歸系數(shù)(R2)按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒=異硫氰酸胍法>SDS法,擴(kuò)增效率按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒>異硫氰酸胍法>SDS法,斜率都在可接受的范圍內(nèi)(-3.1≥斜率≥-3.6);對于生鮮豬肉,三種提取方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較,R2按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒=異硫氰酸胍法>SDS法,擴(kuò)增效率按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒>異硫氰酸胍法>SDS法,斜率都在可接受的范圍內(nèi)(-3.1≥斜率≥-3.6);對于生鮮雞肉,三種提取方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較,R2按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒>SDS法>異硫氰酸胍法,擴(kuò)增效率按照質(zhì)量排序?yàn)?試劑盒>SDS法>異硫氰酸胍法,斜率都在可接受的范圍內(nèi)(-3.1≥斜率≥-3.6)。

表3　不同肉源品種標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較,以本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒法提取的三種動(dòng)物源成分的DNA為模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)和擴(kuò)增效率均優(yōu)于SDS法和異硫氰酸胍法。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2　定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Quantitative standard curve注:1,SDS法;2,異硫氰酸胍法;3,試劑盒法。

2.3方法敏感性實(shí)驗(yàn)

2.3.1羊源性成分方法靈敏度研究以濃度為50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2 pg/μL、640 fg/μL的羊源性成分DNA樣本作為模板時(shí),三種提取方法的羊源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值如圖3,表4所示,根據(jù)《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南》要求,Ct值≥40視為無效擴(kuò)增,Ct值≤38視為典型擴(kuò)增,Ct值在38到40之間經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)依然在該區(qū)間內(nèi)穩(wěn)定擴(kuò)增的視為有效擴(kuò)增。因此雖然在16 pg/μL和3.2 pg/μL有擴(kuò)增曲線,但不符合上述指南要求,無法判定為穩(wěn)定的檢出限,在濃度80 pg/μL時(shí)經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn),三種提取方法的Ct值依然在38～40,可視為有效擴(kuò)增,因此三種提取方法的最低檢出限均為80 pg/μL,空白對照及陰性對照均正常。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于25%,在可接受的范圍之內(nèi),具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性,但對于檢出限都是80 pg/μL的試劑盒法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 0.684%小于異硫酸氰胍法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 0.734%,試劑盒法表現(xiàn)出更加穩(wěn)定的重復(fù)性。

表4　羊源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值

圖3　羊源性成分方法靈敏度研究熒光擴(kuò)增曲線Fig.3　Fluorescent amplification curve of sheep-derived ingredients sensitivity research method

圖4　豬源性成分方法靈敏度研究熒光擴(kuò)增曲線Fig.4　Fluorescent amplification curve of pig-derived ingredients sensitivity research method

表5　豬源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值

2.3.2豬源性成分方法靈敏度研究以濃度為50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2 pg/μL、640 fg/μL的豬源性成分DNA樣本作為模板時(shí),三種提取方法的豬源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值如圖4,表5所示。參照《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南》,雖然本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒法在3.2 pg/μL有擴(kuò)增曲線,但經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值>40,視為無效擴(kuò)增。因此SDS法的最低檢出限為80 pg/μL,異硫氰酸胍法和本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒法的最低檢出限均為16 pg/μL,空白對照及陰性對照均正常。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于25%,在可接受的范圍之內(nèi),具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性,但對于檢出限都是16 pg/μL的試劑盒法，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 0.092%小于異硫酸氰胍法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 4.640%,試劑盒法表現(xiàn)出更加穩(wěn)定的重復(fù)性。

2.3.3雞源性成分方法靈敏度研究以濃度為50、10、2 ng/μL、400、80、16、3.2 pg/μL、640 fg/μL的雞源性成分DNA樣本作為模板時(shí),三種提取方法的雞源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值如圖5,表6所示。參照《實(shí)時(shí)熒光定量國際化標(biāo)準(zhǔn)—MIQE指南》,SDS法和異硫氰酸胍法的最低檢出限均為3.2 pg/μL,本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒法的最低檢出限為640 fg/μL,空白對照及陰性對照均正常。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于25%,在可接受的范圍之內(nèi),具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性。

圖5　雞源性成分方法靈敏度研究熒光擴(kuò)增曲線Fig.5　Fluorescent amplification curve of chicken-derived ingredients sensitivity research method

3　討論與結(jié)論

近年來,以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來鑒定食品中的動(dòng)物源性成分鑒別[9-11],而高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA是影響PCR擴(kuò)增的重要因素,因此快速、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法能成為PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。

表6　雞源性成分靈敏度檢測結(jié)果Ct值

對于樣品的預(yù)處理,本實(shí)驗(yàn)采用液態(tài)氮進(jìn)行冷凍研磨,有效地防止了DNA的降解和斷裂,保證了DNA的完整性。對于樣品的DNA提取方法,SDS法和異硫氰酸胍法操作步驟復(fù)雜,而且提取過程中使用了大量的酚氯仿等有機(jī)溶劑,損害了實(shí)驗(yàn)人員的健康。本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的試劑盒提取法在2 h內(nèi)即可完成樣品DNA提取的全過程,所提取的DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)滿足了后續(xù)PCR擴(kuò)增的要求,同時(shí)避免了SDS法或異硫酸氰胍法提取過程中各種有機(jī)試劑對實(shí)驗(yàn)人員的危害,而且時(shí)間上也得到了很大的提升,更適合于動(dòng)物源性成分鑒定過程中高效快速提取樣品DNA的目的,具有高效、快速、低成本、操作簡便、無毒安全等優(yōu)勢。

本實(shí)驗(yàn)中分別用三種方法提取生鮮羊肉、豬肉和雞肉DNA,并對不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(50%、10%、5%、1%)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,這三類動(dòng)物源成分提取的DNA通過熒光信號(hào)的檢測和比較,試劑盒法提取DNA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率和R2均優(yōu)于SDS法和異硫氰酸胍法。綜上所述,采用SDS法、異硫氰酸胍法和試劑盒法提取的動(dòng)物肌肉組織基因組DNA,雖然均可滿足PCR等后繼分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求,但是試劑盒法在基因組的純度和濃度及穩(wěn)定性方面均優(yōu)于其他兩個(gè)方法,為以后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物源性成分檢測提供了一個(gè)簡單、快速、高效的DNA提取方法。

[1]Brodmann PD,Moor D.Sensitive and semi-quantitative Taq Man TM real-time polymerase chain reaction systems for thedetection of beef(Bos Taurus)and the detection of the family Mammalian in food and feed[J].Meat Science,2003(65):599-607.

[2]潘良文,陳家華,丁燕,等. 進(jìn)口肉骨粉中牛成分檢測研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2001(5):23-26.

[3]徐偉麗,杜明,李啟,等. 動(dòng)物肌肉組織基因組DNA兩種提取方法的比較[J].食品工業(yè)科技,2011,12:81-84.

[4]楊利麗,劉紅英,楊和軍,等. 一種改進(jìn)的異硫氰酸胍法結(jié)合硅膠膜離心吸附柱提取孕婦外周血微量胎兒RNA的方法[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2012(2):177-181.

[5]高丹丹,陳燕,王迎華,等.動(dòng)物肉制品基因組DNA的提取和純化[J].食品科技,2007(8):42-44.

[6]K?ppel R,Ruf J,Rentsch J. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef,pork,horse and sheep[J]. European Food Research and Technology,2011,232(1):151-155.

[7]鮑毅新,孫波,張龍龍,等.對動(dòng)物組織DNA提取方法的改進(jìn)及PCR檢測[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào),自然科學(xué)版,2009,32(3):317-321.

[8]邵碧英,楊婕,張?bào)w銀.動(dòng)物產(chǎn)品的DNA提取方法[J].畜牧與獸醫(yī),2005,37(9):47-49.

[9]周正,呂二盼,周巍,等.動(dòng)物源性食品鴨血、豬血DNA提取方法研究及雙重PCR檢測[J].食品工業(yè),20012(33):161-166.

[10]鐘偉軍,陳金頂. PCR檢測飼料中牛源組織成分的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(3):33-36.

[11]汪永信,安虹,程堅(jiān),等. 雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測食品和飼料中的雞源性成分[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2012(5):134-138.

The method of DNA extraction from animal muscle tissue and real-time PCR detection

LIU Na,ZHAO Xin+,CHEN Rui,WANG Cheng,ZHU Zhu,WANG Yong,LAN Qing-kuo*

(Institute of Tianjin Agriculture Quality Standard and Testing Technology,Tianjin 300381,China)

Genomic DNA of muscle tissues from fresh mutton,pork,chicken,beef,duck were extracted through SDS method,GuSCN method and kit method .The DNA was detected by agarosegel electrophoresis and real-time PCR method. Results indicated that the kit method improved better concentration and purity of DNA than SDS method and GuSCN method. By comparing the three extraction methods to establish standard curve,the sorted according to the quality of the regression coefficients:kit method≥GuSCN method>SDS method. The amplification efficiency according to the sorting for quality was kit method≥GuSCN method>SDS method. The detection sensitivity of sheep-derived ingredients sensitivity by three Extraction Methods,the minimum detection limits were 80 pg/μL,but in the low-concentration detecting the relative standard deviation(RSD)of the kit method 0.684% was less than GuSCN method 0.734% and SDS method 1.075%. The detection of pig-derived ingredients sensitivity,the minimum detection limit of SDS method was 80 pg/μL. The minimum detection limit of GuSCN method and kit method were 16 pg/μL,but in the low-concentration detecting the relative standard deviation(RSD)of the kit method 0.092% was less than GuSCN method 4.640%. The detection of chicken-derived ingredients sensitivity,the minimum detection limit of SDS method and GuSCN method were 3.2 pg/μL,the minimum detection limit of kit method was 640 fg/μL. Above all,the genomic DNA from kit method was more conducive to use the real-time PCR technique in food adulteration and species identification.

animal muscle;SDS method;GuSCN method;kit method;DNA;Real-time PCR

2016-03-08+并列第一作者。

劉娜(1987-),女,大學(xué)本科,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品分子檢測技術(shù)研究,E-mail:zhaoxin2008999@126.com。

趙新(1983-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品分子檢測技術(shù)研究，E-mail:zhaoxin2008999@163.com。

蘭青闊(1980-),男,碩士,副研究員,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量分子檢測技術(shù),E-mail:lanqingkuo@163.com。

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(14JCQNJC14800)資助。

TS251.1

A

1002-0306(2016)18-0074-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.006