張　棟,馮麗莉,薛玉玲,王　華,荀一萍,李興佳,朱　宏,*,王世杰,2,*

(1.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司,河北石家莊 050000;2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610041)

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PMA-qPCR方法快速檢測(cè)LactobacillusparacaseiN1115活菌的初步研究

張棟1,馮麗莉1,薛玉玲1,王華1,荀一萍1,李興佳1,朱宏1,*,王世杰1,2,*

(1.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司,河北石家莊 050000;2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都 610041)

目的:建立快速準(zhǔn)確的副干酪乳桿菌N1115(LactobacillusParacaseiN1115)活菌的熒光定量檢測(cè)方法并應(yīng)用于菌粉的活菌計(jì)數(shù)。方法:根據(jù)副干酪乳桿菌N1115的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亞基基因(pheS)設(shè)計(jì)特異性引物;使用疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide PMA)抑制死菌DNA擴(kuò)增,然后通過(guò)qPCR的方法檢測(cè)菌粉中的N1115的活菌數(shù)。結(jié)果:經(jīng)驗(yàn)證得到一對(duì)N1115特異引物:C15F、C15R;副干酪乳桿菌N1115在90 ℃水浴條件下熱損傷時(shí)間為8 min;PMA對(duì)于N1115死菌DNA的擴(kuò)增有明顯的抑制效果;PMA-qPCR能夠快速準(zhǔn)確的測(cè)得菌粉中N1115活菌數(shù)。結(jié)論:建立了一種快速、準(zhǔn)確的副干酪乳桿菌N1115活菌的熒光定量檢測(cè)方法。

副干酪乳桿菌N1115,疊氮溴化丙錠,熒光定量PCR

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)為乳桿菌屬干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)的一個(gè)亞種,常被用作酸奶和干酪等乳制品的發(fā)酵劑或輔助發(fā)酵劑,是近年來(lái)研究較多的一種益生乳酸菌[1]。副干酪乳桿菌N1115是一株分離于傳統(tǒng)發(fā)酵乳中的具有益生功能的副干酪乳桿菌[2]。研究表明,副干酪乳桿菌N1115在低pH和高膽鹽環(huán)境下仍然能夠較好的存活,有良好的益生菌潛質(zhì),可用于酸奶及酸奶飲料的制作[3]。在含有副干酪乳桿菌N1115的乳制品生產(chǎn)中,活菌數(shù)作為一個(gè)重要的數(shù)據(jù)需要反復(fù)的檢測(cè)。然而傳統(tǒng)的活菌數(shù)檢測(cè)方法繁瑣檢測(cè)周期較長(zhǎng)難以滿足現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)的需求。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠簡(jiǎn)單快速檢測(cè)副干酪乳桿菌N1115活菌數(shù)的方法顯得尤為重要。

近年來(lái),眾多科學(xué)工作者嘗試使用熒光定量PCR的方法進(jìn)行微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn),熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)具有特異性好、靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高和速度快等優(yōu)點(diǎn),自推出以來(lái)被迅速應(yīng)用到食品中微生物的快速檢測(cè)[4-5]。吳燕濤等采用qPCR法測(cè)定了發(fā)酵乳中雙歧桿菌的數(shù)量[6]。張力文等通過(guò)qPCR法檢測(cè)人糞便中雙歧桿菌[7]。趙勝娟運(yùn)用qPCR法檢測(cè)雙歧桿菌對(duì)小鼠腸道菌群的變化[8]。陳津津等通過(guò)qPCR方法檢測(cè)幼兔糞便雙歧桿菌[9]。目前,與雙歧桿菌和其他益生菌相比副干酪乳桿菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)方法研究較少,對(duì)于某一株副干酪乳桿菌的檢測(cè)和計(jì)數(shù)研究更為少見(jiàn)。王力均等[1]使用細(xì)菌通用引物能夠通過(guò)PMA-qPCR方法檢測(cè)只含有副干酪乳桿菌的樣品,然而對(duì)于含有多種益生菌的產(chǎn)品或者對(duì)某特定副干酪乳桿菌菌株的檢測(cè)和計(jì)數(shù)國(guó)內(nèi)仍未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)于常規(guī)的熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)無(wú)法區(qū)分死菌和活菌的DNA可能引起檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果,本研究采用了一種核酸交聯(lián)試劑疊氮溴化丙錠(PMA),它能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞膜受損的死菌并阻止其PCR擴(kuò)增,同時(shí)不會(huì)影響活菌DNA的PCR擴(kuò)增[10-11]。

苯丙氨酰-tRNA合成酶a亞基基因(pheS)是一種看家基因(housekeeping genes),乳桿菌屬的pheS具有較大差異,種間差異一般高于10%而種內(nèi)差異達(dá)到2%[12]。以此為依據(jù)利用副干酪乳桿菌N1115的pheS基因設(shè)計(jì)出滿足熒光定量實(shí)驗(yàn)要求的副干酪乳桿菌N1115特異性引物,本研究以副干酪乳桿菌N1115為研究對(duì)象,利用pheS基因的特異性設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)PMA處理與熒光定量PCR結(jié)合的方法,建立了一種能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)副干酪乳桿菌N1115活菌數(shù)的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

副干酪乳桿菌N1115為本實(shí)驗(yàn)室由傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離保藏,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定保存,專利保藏號(hào):CGMCC4691;干酪乳桿菌CICC 6117購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物保藏管理中心;鼠李糖乳桿菌 JMCC 1001分離自傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品,由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存;植物乳桿菌 JMCC0108分離自云南大理傳統(tǒng)發(fā)酵乳,由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存[13];溶菌酶北京索萊寶科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、SuperReal Permix Plus(SYBRGreen)天根生化科技有限公司。

D-37520型凈化工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DPX-25BS-11型生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;CX31RTSF型顯微鏡日本奧林巴斯;D-37520型高速離心機(jī)賽默飛世爾科技有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;XR+型凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)伯樂(lè)BIO-RAD公司;2720型PCR儀美國(guó)Aplied Biosystem 公司;羅氏96熒光定量PCR儀瑞士Roche公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1特異引物的篩選通過(guò)副干酪乳桿菌N1115的中國(guó)微生物所菌種鑒定保藏中心的鑒定結(jié)果中出具的pheS基因序列,使用DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),根據(jù)試劑公司技術(shù)手冊(cè)上目的片段長(zhǎng)度不超過(guò)400 bp的原則,選擇適宜作為熒光定量計(jì)數(shù)引物3組送上海生工生物科技有限公司合成,引物信息見(jiàn)表1。

表1　引物信息

采用本實(shí)驗(yàn)室保藏的與副干酪乳桿菌N1115遺傳距離相近的干酪乳桿菌CICC6117、鼠李糖乳桿菌JMCC1001、植物乳桿菌JMCC0108,作為對(duì)照組進(jìn)行引物的特異性篩選。

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照說(shuō)明提取以上菌株和副干酪乳桿菌N1115的DNA作為模板,分別以三組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總體系為20 μL:10 μL 2×Taq PCR Master Mix,DNA模板2 μL,正反向引物各1 μL,加無(wú)菌水至20 μL。

PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠120 V電壓進(jìn)行電泳,用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像,瓊脂糖凝膠使用GoldView染色,以副干酪乳桿菌N1115能夠擴(kuò)增出目的條帶且其他菌株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的引物作為熒光定量PCR引物。

再通過(guò)熒光定量溶解曲線圖對(duì)引物的特異性進(jìn)一步分析,確定引物特異性。熒光定量PCR 的反應(yīng)體系為25 μL:12.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq,0.75 μL 10 mmol的正反向引物,2 μL基因組DNA,用去離子水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,58 ℃退火30 s 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),并在上述擴(kuò)增條件后增加65 ℃至96 ℃溶解曲線分析步驟。

1.2.2熱滅活時(shí)間測(cè)定為了建立死菌對(duì)照組,設(shè)計(jì)熱致死實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行L.paracaseiN1115的死菌制備。取活化好的副干酪乳桿菌N1115 MRS菌懸液1～1.5 mL離心管中,離心去上清加入1 mL生理鹽水洗滌后重懸,于90 ℃水浴分別放置0、1、4、6、8、10 min后立即置于冰上冷卻,利用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法[14]測(cè)定各管中活菌數(shù)每組設(shè)置3個(gè)平行,確定副干酪乳桿菌N1115在90 ℃水浴條件下的致死時(shí)間。

1.2.3菌懸液的PMA處理和DNA提取取副干酪乳桿菌N1115菌液,取0.5 μL濃度為10 mg/mL的PMA 溶液加入到1 mL菌懸液中(PMA終濃度為5 μg/mL),充分混勻后,室溫避光5 min。用500 W鹵素?zé)羝毓? min,且光源距離心管的垂直距離為20 cm。曝光期間離心管置于冰上并持續(xù)搖晃離心管,避免局部過(guò)熱和保證反應(yīng)充分。曝光結(jié)束后12000 r/min離心5 min,棄上清,無(wú)菌水洗滌2次后重懸備用[1]。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)上述菌體DNA進(jìn)行提取后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PMA抑制死菌擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)以1.2.3中所提取DNA為模板,以表1中C15F和C15R作為引物，以1.2.1中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè),同時(shí)設(shè)置3個(gè)對(duì)照組:A組:未經(jīng)任何處理的菌株DNA作為模板;B組:熱處理后未進(jìn)行PMA處理的菌株DNA作為模板;C組未經(jīng)熱處理直接進(jìn)行PMA處理的菌株DNA作為模板，一個(gè)空白對(duì)照組:以H2O為模板,進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后,1%瓊脂糖凝膠120 V電壓電泳后使用BIO-RAD成像系統(tǒng)成像,瓊脂糖凝膠使用GoldView染色。

表2　熱處理后菌懸液活菌數(shù)

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取活化后的副干酪乳桿菌N1115菌懸液,首先進(jìn)行傳統(tǒng)梯度稀釋倒平板法活菌計(jì)數(shù),確定其副干酪乳桿菌N1115的活菌數(shù),然后將菌懸液連續(xù)10倍梯度稀釋4次,經(jīng)過(guò)1.2.3中PMA處理后參照1.2.1提取基因組DNA作為熒光定量PCR的模板,以表1中C15F、C15R作為引物,進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。熒光定量PCR 的反應(yīng)體系為25μL:12.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq,0.75 μL 10 mmol的正反向引物,2 μL基因組DNA,用去離子水補(bǔ)齊至25 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,58 ℃退火30 s 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,計(jì)算三次Ct值的平均值,以Ct值的平均值為縱坐標(biāo),以DNA模板對(duì)應(yīng)的副干酪乳桿菌的活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6實(shí)際樣品的檢測(cè)采用工廠生產(chǎn)的副干酪乳桿菌N1115益生菌菌粉樣品,取0.1 g樣品進(jìn)行傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù),同時(shí)取0.01 g樣品溶于1 mL生理鹽水后通過(guò)1.2.3中方法對(duì)樣品進(jìn)行PMA處理和DNA提取,通過(guò)1.2.4中方法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增后,分別檢測(cè)該菌粉中活菌數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1特異引物的篩選

經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)成像,3組引物在對(duì)不同菌株進(jìn)行擴(kuò)增后結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1　A組B組引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　The PCR result of the groupA and groupB注:M:D2000Marker;1:副干酪乳桿菌N1115;2:干酪乳桿菌CICC6117;3:植物乳桿菌JMCC0108;4：鼠李糖乳桿菌JMCC1001。

圖2　C組引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　The PCR result of the group C

由圖1、圖2可知,A組引物特異性較差在其他相近種也出現(xiàn)了條帶;B組引物目的條帶沒(méi)有出現(xiàn)且其他三株菌也出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物,而C組引物在瓊脂糖凝膠電泳圖中表現(xiàn)出良好的引物特異性,在擴(kuò)增出明亮的目的片段的同時(shí)其他相近菌株均未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。因此選取C組引物進(jìn)行溶解曲線分析,溶解曲線如圖3所示,溶解曲線為單一峰未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。

圖3　C組引物溶解曲線Fig.3　Melting curves of the primer C

2.2熱處理時(shí)間的選擇

熱處理后活菌計(jì)數(shù)結(jié)果取三組平行的算數(shù)平均值,如表2所示。

由表2可知,經(jīng)過(guò)8 min 90 ℃水浴后,計(jì)數(shù)平板中未出現(xiàn)菌落,因此采用8 min作為熱處理時(shí)間。

2.3PMA抑制死菌擴(kuò)增效果

經(jīng)過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)成像,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　PMA抑制L.paracasei N1115死菌擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4　The result of control the amplification of the dead L.paracasei N1115注:M:D2000 Maker,1:活菌未處理,2:活菌PMA處理,3:熱致死后未處理,4:熱致死后PMA處理,5:空白對(duì)照。

由圖4可以觀察到,先經(jīng)過(guò)熱致死然后進(jìn)行PMA處理的實(shí)驗(yàn)組與未進(jìn)行PMA處理的對(duì)照組比較擴(kuò)增得到了明顯的抑制,而對(duì)于活菌PMA處理組與未處理組沒(méi)有明顯的差別。因此PMA能夠有效的抑制死菌DNA擴(kuò)增,不影響活菌的DNA擴(kuò)增,從而抑制了檢測(cè)中假陽(yáng)性結(jié)果的產(chǎn)生。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的平板活菌計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)得到菌懸液活菌數(shù)為8.16×108CFU/mL。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　qPCR實(shí)驗(yàn)Ct值

以表3中Ct值的平均值為縱坐標(biāo),活菌濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖5。

圖5　副干酪乳桿菌N1115熒光定量PCR計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　The qPCR standard curve of L.paracasei N1115

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知,Ct值與菌濃度的對(duì)數(shù)值之間程線性關(guān)系,關(guān)系式為y=-3.417x+41.923,R2=0.9995。

2.5實(shí)際樣品檢測(cè)

使用傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)方法測(cè)得副干酪乳桿菌N1115菌粉活菌數(shù)為1.93×1010CFU/g,使用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)副干酪乳桿菌菌粉樣品的檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果通過(guò)2.4中關(guān)系式計(jì)算出活菌數(shù),檢測(cè)結(jié)果和計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　副干酪乳桿菌N1115菌粉樣品熒光定量檢測(cè)結(jié)果

由表4可知,通過(guò)熒光定量PCR計(jì)數(shù),未經(jīng)PMA處理組的Ct值明顯低于PMA處理組,說(shuō)明PMA抑制了其中死菌的擴(kuò)增,保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性,PMA處理組計(jì)數(shù)結(jié)果為1.698×1010CFU/g，與傳統(tǒng)方法測(cè)得的結(jié)果接近。

3　結(jié)論

根據(jù)pheS基因的特異性設(shè)計(jì)適于副干酪乳桿菌N1115的特異性引物,結(jié)合PMA的特性與熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn),研究出一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)副干酪乳桿菌N1115活菌數(shù)的方法。將傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)所需3 d時(shí)間縮短到1 d內(nèi)即可完成。根據(jù)本方法可檢測(cè)副干酪乳桿菌N1115益生菌菌粉中活菌數(shù),通過(guò)開(kāi)發(fā)快速的活菌計(jì)數(shù)方法,為副干酪乳桿菌N1115的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ),但是實(shí)驗(yàn)條件仍有待優(yōu)化比如PMA濃度等。

[1]王力均,譚強(qiáng)來(lái),朱江,等. 應(yīng)用PMA-qPCR方法快速準(zhǔn)確檢測(cè)發(fā)酵乳制品中副干酪乳桿菌活菌的研究[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2013(1):1-4.

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Study on PMA-qPCR assay for rapid and accurate detection of viableLactobacillusparacaseiN1115

ZHANG Dong1,FENG Li-li1,XUE Yu-ling1,WANG Hua1,XUN Yi-ping1,LI Xing-jia1,ZHU Hong1,*,WANG Shi-jie1,2,*

(1.The Shijiazhuang Junlebao Dairy Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050000,China;2.West China School of Public Health,Sichan University,Chengdu 060041,China)

Objective:To develop a fast and accurate live bacteria fluorescent quantitative detection method applied in the viable count ofLactobacillusparacaseiin bacterial powder. Methods:Specific primers were designed according to Phenyl alanine-tRNA synthetase alpha subunit gene(pheS)ofL.paracaseiN1115. Propidium monoazide(PMA)was used to suppress dead bacteria DNA amplification,and then the qPCR method was used to detect bacteria powder in the number of live bacteria N1115. Results:Specific and verified primers ofL.paracaseiN1115 were:C15F,C15R. The thermal damage time ofL.paracaseiN1115 was 8 min in the 90 ℃ water bath. PMA could obviously control the amplification of deadL.paracaseiN1115 . The way of PMA-qPCR could detect the number of livingL.paracaseiN1115 rapidly and accurately. Conclusion:A PMA-qPCR assay had been developed for rapid and accurate detection of viableL.paracaseiN1115.

LactobacillusparacaseiN1115;propidium monoazide;qPCR

2016-01-18

張棟(1987-),男,碩士,研究方向：食品微生物篩選與應(yīng)用技術(shù)研究,E-mail:zhangdong18540@jlbry.com。

朱宏(1964-),男,博士,正高級(jí)工程師,研究方向：動(dòng)物食品研究,E-mail:zhuhong@jlbry.com。

王世杰(1980-),男,博士,正高級(jí)工程師,研究方向：微生物及乳制品研究,E-mail:wangshijie@jlbry.com。

河北省重大成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目專項(xiàng)項(xiàng)目(14047104Z)。

TS252

A

1002-0306(2016)18-0070-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.005