徐瀟穎,劉　柱,梁晶晶,周　霞,羅金文

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江杭州 310052)

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全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲用水中3種微囊藻毒素

徐瀟穎,劉柱,梁晶晶,周霞,羅金文*

(浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江杭州 310052)

建立全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲用水中3種微囊藻毒素的方法。采用全自動(dòng)固相萃取儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的前處理方式,對(duì)大體積水樣進(jìn)行富集,以KH2PO4(pH=3.0)-甲醇(43∶57,v∶v)為流動(dòng)相,采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果3種微囊藻毒素在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r2≥0.999,3種不同微囊藻毒素的檢出限均可達(dá)到0.05 μg/L(S/N=3),加標(biāo)回收率在86.3%～99.7%范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.70%～2.72%(n=6),該方法用于測(cè)定飲用水中3種微囊藻毒素具有操作簡(jiǎn)單、快速,精密度高、準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)。

全自動(dòng)固相萃取,微囊藻毒素YR,微囊藻毒素LR,微囊藻毒素RR,飲用水

由于水體富營(yíng)養(yǎng)化及污染問題日益嚴(yán)重,導(dǎo)致藍(lán)藻水華頻發(fā),隨之產(chǎn)生的微囊藻毒素污染問題也日益受到重視。微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是藍(lán)藻釋放的有毒代謝物[1-2],現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)不同的微囊藻毒素同分異構(gòu)體共60余種,其中MC-RR,MC-LR,MC-YR最為常見,該類毒素毒性很強(qiáng),主要對(duì)哺乳動(dòng)物的肝臟產(chǎn)生損害[3]。世界衛(wèi)生組織在其推薦的飲用水標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)中也增加了微囊藻毒素(MC-LR,1 μg/L),而國(guó)內(nèi)現(xiàn)行《生活飲用水衛(wèi)生規(guī)范》和《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中也規(guī)定微囊藻毒素LR≤0.001 mg/L[4]。

目前用于檢測(cè)水體及藍(lán)藻中微囊藻毒素的方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5]、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)[6]、生物分析法[7],以及常用的高效液相色譜法[8-9]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10]。在采用高效液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)水體中微囊藻毒素進(jìn)行測(cè)定的過程中,由于微囊藻毒素在飲用水中的殘留量低,水樣體積大,前期富集大多存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力或消耗大量有機(jī)溶劑等缺點(diǎn),除馮桂學(xué)[11]等進(jìn)行了簡(jiǎn)化前處理研究外,他人尚無研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

飲用水市售;MC-LR,MC-YR,MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%)美國(guó)Enzo公司;甲醇(色譜純)德國(guó)Merck公司;實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純,北京化學(xué)試劑公司。

表1　全自動(dòng)固相萃取儀富集洗脫條件

高效液相色譜儀Agilent 1260型,配備二極管陣列(DAD)檢測(cè)器,Aglient化學(xué)工作站;全自動(dòng)固相萃取儀(Fotector plus)Reeko;Milli-Q純水儀密里博。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1全自動(dòng)固相萃取儀富集條件采用全自動(dòng)固相萃取儀設(shè)定洗脫程序,利用HLB固相萃取柱(Waters,500 mg,6 mL)按表1進(jìn)行富集洗脫程序設(shè)定,對(duì)500 mL水樣進(jìn)行前處理富集。

1.2.2色譜條件色譜柱:Shim-pack VP-ODS C18(250×4.6 nm,5 μm);柱溫:40 ℃;檢測(cè)器:二極管陣列;檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.9 mL/min;流動(dòng)相條件1(等度洗脫):KH2PO4緩沖溶液∶甲醇=43∶57;流動(dòng)相條件2(等度洗脫):乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62;流動(dòng)相條件3(等度洗脫):乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將MC-LR、MC-YR、MC-RR標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 mg分別用甲醇定容至5.0 mL,配制成20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。用甲醇配制濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以儀器響應(yīng)的峰面積Y對(duì)應(yīng)濃度X(μg/mL)進(jìn)行線性回歸。

1.2.4樣品溶液制備樣液經(jīng)過全自動(dòng)固效萃取儀的富集程序后,40 ℃下氮?dú)獯蹈?用洗脫液定容至1.0 mL。用0.22 μm濾膜過濾后,待上機(jī)。

1.2.5回收率實(shí)驗(yàn)對(duì)陰性樣品進(jìn)行三個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn),加標(biāo)濃度分別為0.3、0.6、1.0 μg/L,每個(gè)濃度進(jìn)行6組平行性實(shí)驗(yàn)。

1.2.6精密度實(shí)驗(yàn)對(duì)陰性樣品進(jìn)行三倍檢出限加標(biāo)測(cè)定,在0.15 μg/L濃度下進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與討論

2.1色譜條件的選擇

據(jù)報(bào)道[12],利用高效液相色譜對(duì)微囊藻毒素進(jìn)行測(cè)定,多采用甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)或乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62(v/v)做為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)兩種不同流動(dòng)相進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:當(dāng)選用乙腈/水(0.04% TFA)作為流動(dòng)相時(shí),標(biāo)樣色譜圖見圖1,出峰時(shí)間短,但MC-YR和MC-RR峰中包含雜質(zhì),分離度較差。改變流動(dòng)相比例為乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60(v/v)進(jìn)行分離后,這兩種微囊藻毒素回收率偏低,見圖2。在選用甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)對(duì)三種微囊藻毒素進(jìn)行分離時(shí),三種不同的微囊藻毒素可達(dá)到有效分離,色譜圖見圖3。故優(yōu)選甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43(v/v)為流動(dòng)相進(jìn)行微囊藻毒測(cè)定。

圖1　3種微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(以乙腈∶水(0.04% TFA)=38∶62為流動(dòng)相)Fig.1　Chromatogram of Mcs with ancetonitrile-water(0.04% TFA)as mobile phase

圖2　3種微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(以乙腈∶水(0.04% TFA)=40∶60為流動(dòng)相)Fig.2　Chromatogram of Mcs with ancetonitrile-water(0.04% TFA)as mobile phase

2.2線性評(píng)價(jià)及檢出限

按照優(yōu)化后的色譜條件對(duì)3種微囊藻毒素進(jìn)行檢測(cè),在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)以儀器響應(yīng)的峰面積Y對(duì)應(yīng)濃度X(μg/mL)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明MC-RR、MC-LR、MC-YR在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2≥0.999,采用空白水樣加標(biāo)的方法,以儀器信噪比(S/N=3)計(jì)算方法檢出限(LOD)可達(dá)到0.05 μg/L,結(jié)果見表2。該方法檢出限要低于吳振興等[13]利用高效液相質(zhì)譜聯(lián)法獲得的1 μg/L。

表2　3種微囊藻毒素的線性方程及檢出限

圖3　3種微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(以甲醇/磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0)=57∶43為流動(dòng)相)Fig.3　Chromatogram of Mcs with phosphate buffer solution(pH=3.0)-methanol(57∶43)as mobile phase

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)某品牌飲用水A(陰性樣品)進(jìn)行三種微囊藻毒素的精密度測(cè)定,定量限加標(biāo)濃度為0.15 μg/L,進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表3。從表3中可看出,3種微囊藻毒素的測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.70%～2.72%,表明采用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行富集,各水平下測(cè)定值均呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定性,該方法具有較高的精密度,且平行性較好。

表3　3種微囊藻毒素精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)某品牌飲用水A(陰性樣品)進(jìn)行不同水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),加標(biāo)濃度分別為0.3、0.6、1.0 μg/L,每一濃度進(jìn)行6組平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4,除MC-RR在0.3 μg/L濃度下回收率為86.3%外,其余加標(biāo)水平的回收率在91.1%～99.7%,說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表4　回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5　樣品測(cè)定結(jié)果

注:ND即視為低于檢出限0.05 μg/L。

2.5實(shí)際樣品測(cè)定

按照本方法對(duì)市售5個(gè)品牌飲用水A,B,C,D,E進(jìn)行微囊藻毒素的測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表5。其中一個(gè)品牌飲用水中檢出MC-YR,為陽性樣品,而該指標(biāo)在現(xiàn)行國(guó)標(biāo)中并未做出規(guī)定。

3　結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)固相萃取儀代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工過柱,相對(duì)于傳統(tǒng)的前處理方法,該方法在設(shè)定洗脫程序的流速后,可達(dá)到儀器的全自動(dòng)化,通過6個(gè)相對(duì)獨(dú)立蠕動(dòng)泵可同時(shí)進(jìn)行6個(gè)樣品的富集。大大縮短了洗脫時(shí)間,提高了洗脫效率,控制了洗脫速度,減小了由前處理造成的實(shí)驗(yàn)誤差。通過不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)3種微囊藻毒素在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r2≥0.999,3種不同微囊藻毒素的檢出限均可達(dá)到0.05 μg/L,精密度實(shí)驗(yàn)中獲得標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.70%～2.72%之間,加標(biāo)回收率在86.3%～99.7%范圍內(nèi),證明本實(shí)驗(yàn)方法可達(dá)到飲用水中微囊藻毒素的檢測(cè)準(zhǔn)確度和精確度。

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Determination of three microcystins in drinking water by automatic-SPE and HPLC

XU Xiao-ying,LIU Zhu,LIANG Jing-jing,ZHOU Xia,LOU Jin-wen*

(Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)

Three microcystins were determined by automatic solid phase extraction(SPE)and high performance liquid chromatography(HPLC)in this study. Instead of the traditional pretreatment methods,Reeko automatic-SPE system was used for a fast enrichment process. Samples were chromatographed isocratically using a KH2PO4(pH3.0)buffer solution-methanol mobile phase on a C18column in-line by diode array detector. Good linear relation were presented in the range of 0.1～10.0 μg/mL for all microcystins with the correlation coefficientsR2≥0.999. The detection limits of three microcystins were 0.05 μg/L(S/N=3).Recoveries of these microcystins at three different concentration levels were studied. The recoveries of this method were 86.3%～99.7% with a good relative standard deviations of 1.70%～2.72%(n=6). This method was easy,fast and accurate and suitable for a rapid determination of microcystins in drinking water.

automatic-SPE;microcystin(YR);microcystin(LR);microcystin(RR);drinking water

2016-02-17

徐瀟穎(1989-)，女，碩士，助理工程師，研究方向：食品安全與分析技術(shù)，E-mail:net_easexxy@126.com。

羅金文(1974-)，男，碩士，高級(jí)藥師，研究方向：食品安全與分析技術(shù)，E-mail:luojw31@163.com。

浙江省科學(xué)技術(shù)廳重大科技專項(xiàng)重大農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2014C02001)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)18-0060-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.18.003