劉麗娜，秦順義，姚婉，趙方紅

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，天津西青300384）

檢測(cè)分析

不同乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌的抑制作用

劉麗娜，秦順義*，姚婉，趙方紅

（天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，天津西青300384）

本試驗(yàn)采用雙培養(yǎng)平板法和劉振宇等（2005）的方法研究嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、口乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)抑制效果的影響。結(jié)果表明，三種不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別達(dá)到了30%，43%，65%；對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)的抑制率隨著菌株培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。結(jié)果提示，三種乳酸菌對(duì)于玉蜀黍赤霉菌菌絲的生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)都有一定程度抑制作用，其中口乳桿菌的抑制效果最好。

嗜酸乳桿菌；鼠李糖乳桿菌；口乳桿菌；玉蜀黍赤霉菌；抑制率

玉蜀黍赤霉（Gibberellazeae Schwein.Petch），其無(wú)性時(shí)期為禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum Schwabe），是我國(guó)玉米赤霉病的主要致病菌（袁善奎等，2004），它主要污染谷物類（Proctor，1995），并且能夠產(chǎn)生一些真菌毒素，對(duì)人和動(dòng)物的健康造成一定的威脅（Marasas等，1984）。玉米赤霉烯酮是次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有雌激素毒性、肝毒性、腎毒性以及基因毒性等，能引起動(dòng)物流產(chǎn)、死胎、返情等生殖機(jī)能異常，還可以導(dǎo)致生長(zhǎng)下降、免疫抑制、不育、畸形等（鄧友田等，2007）。目前國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮的去毒方法有物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。雖然物理方法、化學(xué)方法在一定程度上可以降低玉米赤霉烯酮對(duì)人類造成的危害，但存在一定的局限性（蔡雨函，2012）。生物學(xué)方法由于利用微生物吸附毒素和代謝產(chǎn)物，具有安全、高效、無(wú)二次污染的特點(diǎn)（王宏祥等，2014；蔡雨函等，2012），成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

乳酸菌能夠產(chǎn)生乳酸、抗菌素等物質(zhì)，對(duì)玉米赤霉烯酮的生長(zhǎng)及毒性產(chǎn)生一定的影響（張柏林等，2005）。近年來(lái)，乳酸菌對(duì)一些霉菌的抑制作用及相關(guān)抑菌機(jī)制也得到闡明（于向榮等，2013；郭艷萍等，2010）。本試驗(yàn)主要研究不同乳酸菌對(duì)玉米赤霉烯酮的拮抗效果，為研制高效、安全、無(wú)污染的玉米赤霉烯酮去除劑提供思路。

1　材料與方法

1.1材料菌種：玉蜀黍赤霉菌，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；乳酸菌株：嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、口乳桿菌，實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：PDA瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）。MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水定容1000 mL，pH 6.8，121℃高壓滅菌15 min，分裝，待用。MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂，121℃高壓滅菌15 min，冷卻后倒入平板內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水定容至1000 mL，121℃高壓滅菌15 min，分裝，待用。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入20 g的瓊脂，121℃高壓滅菌15 min，冷卻后倒入平板內(nèi)，置于4℃冰箱內(nèi)待用。

1.2方法

1.2.1菌種的活化及純化將凍存的嗜酸乳桿菌接種于MRS固體培養(yǎng)基中，然后將平皿用封口膜包好，以隔絕氧氣，37℃培養(yǎng)48 h。48 h后挑取菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)，直至將細(xì)菌純化。之后挑取菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃、120 r/min活化培養(yǎng)32 h，4℃冰箱保存。

將凍存的鼠李糖乳桿菌和口乳桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。24 h后，挑取菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)，直至將細(xì)菌純化。之后挑取菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，120 r/min活化培養(yǎng)24 h，4℃冰箱內(nèi)待用。

1.2.2玉蜀黍赤霉菌的培養(yǎng)在無(wú)菌的條件下，將保存于斜面中的菌種接種在PDA固體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)5～7 d直至長(zhǎng)出大量的菌絲。

1.2.3孢子懸液的制備將活化的玉蜀黍赤霉菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)10 d，加入10 mL 0.05%吐溫-80（V/V），然后用無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)整到1×107cfu/mL，-20℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制測(cè)定采用了雙培養(yǎng)平板法：分別在PDA培養(yǎng)基內(nèi)距中心3 cm處四個(gè)不同的位置接種乳酸菌液各10 μL，對(duì)照組以無(wú)菌水代替，于37℃培養(yǎng)1 d，隨后在該培養(yǎng)基的正中央接種10 μL的孢子液，于28℃培養(yǎng)4 d后測(cè)量其直徑。

1.2.5乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)的影響參照劉振宇（2015）的方法，將乳酸菌液與孢子液等體積混合，28℃培養(yǎng)，分別在12、18、24、36、48 h檢查孢子的萌發(fā)狀況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。用無(wú)菌水代替菌液為對(duì)照。

2　結(jié)果

2.1玉蜀黍赤霉菌的形態(tài)特征玉蜀黍赤霉菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5～7 d發(fā)現(xiàn)，玉蜀黍赤霉菌在培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量氣生菌絲，菌絲為白色，呈絨狀。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲越來(lái)越旺盛，菌落基質(zhì)從白色逐漸變?yōu)榫萍t色，其中有一部分是深紅色。

2.2乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制的影響由圖1可見(jiàn)，嗜酸乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)的抑制率為30%，鼠李糖乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)的抑制率為43%，而口乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)的抑制率高達(dá)65%。表明三種不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

圖1　不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)抑制的影響

2.3乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)抑制的影響由圖2可見(jiàn)，嗜酸乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)的抑制率是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸增加的，但是在24～48 h時(shí)，上升趨勢(shì)變緩慢；鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)12～24 h其孢子萌發(fā)抑制率基本呈直線上升，之后呈下降的趨勢(shì)；口乳桿菌在培養(yǎng)12～48 h其孢子萌發(fā)抑制率基本呈直線上升的趨勢(shì)。

圖2　不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)抑制的影響

圖2不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)抑制的影響

3　討論

本試驗(yàn)主要是探究嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、口乳桿菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)抑制效果的影響。經(jīng)試驗(yàn)得出，三種不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有較強(qiáng)的抑制作用。目前，關(guān)于乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌拮抗的機(jī)理有：（1）乳酸菌的代謝產(chǎn)物對(duì)真菌菌株的抑制；（2）乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了抑制復(fù)合物；（3）真菌毒素與乳酸菌細(xì)胞壁之間的物理結(jié)合效果（張柏林等，2005）。

3.1乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制的影響大量研究報(bào)道，乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。乳酸菌通過(guò)形成有機(jī)酸或者產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，可以控制其他微生物的生長(zhǎng)（張柏林等，2005）。在乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各乳酸菌均對(duì)玉蜀黍赤霉菌菌絲的生長(zhǎng)起到一定的抑制作用，但是嗜酸乳桿菌的抑制率較低，原因可能是嗜酸乳桿菌傳代的次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致乳酸菌的表面性質(zhì)或者其表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化。

3.2乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)抑制的影響大量研究報(bào)道表明，乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)有一定的抑制作用。乳酸菌通過(guò)產(chǎn)生大量的過(guò)氧化氫對(duì)玉蜀黍赤霉菌的孢子萌發(fā)進(jìn)行控制。Ponts等（2006）認(rèn)為禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)率可能受到了過(guò)氧化氫的影響。Dalié等（2010）認(rèn)為孢子液與0.5 mol/L的過(guò)氧化氫一起培養(yǎng)會(huì)顯著降低霉菌毒素，如單端孢霉烯。在乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各乳酸菌種均對(duì)玉蜀黍赤霉菌孢子萌發(fā)起到一定的抑制作用，但是嗜酸乳桿菌的抑制率較低，原因可能是嗜酸乳桿菌傳代的次數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致乳酸菌產(chǎn)生了極少量的過(guò)氧化氫。

4　結(jié)論

玉蜀黍赤霉菌廣泛存在于霉變的玉米、高粱、小麥、大麥等農(nóng)作物及動(dòng)物飼料中，經(jīng)動(dòng)物采食后會(huì)殘留于畜產(chǎn)品中，導(dǎo)致肉、乳及其制品的污染，間接對(duì)人類健康造成重大危害。通過(guò)本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、口乳桿菌三種不同的乳酸菌對(duì)玉蜀黍赤霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均具有較強(qiáng)的抑制作用，并且乳酸菌無(wú)毒無(wú)害，具有一定的保健功效，因此，研究結(jié)果為研制高效、安全、無(wú)污染的玉米赤霉烯酮去除劑提供了新思路。

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The study was conducted to evaluate the effect of Lactobacillus acidophilus，Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus oris on inhibiting the mycelia growth，spore germination of Gibberella zeae.Double culture plate and the method of Liu Zhenyu was used in this test.The results showed that three different kinds of lactic acid bacteria had strong antagonistic activity on the mycelia growth and spore germination.The inhibition percentage of three different kinds of lactic acid bacteria against the mycelia growth of Gibberella zeae reached by 30%，43%，65%，respectively.Inhibition percentage against the spore germination of Gibberella zeae gradually increased with the culture tmie prolonged.The results indicated that three different kinds of lactic acid bacteria had a certain degree of inhibition to the growth of Gibberella zeae，spore germination，the inhibition effect of Lactobacillus oris was the best.

Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus rhamnosus；Lactobacillus oris；Gibberella zeae；inhibition percentage

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161503

S816.7

A

1004-3314（2016）15-0013-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101867）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（15JCYBJC30600）