范麗莉 王炎 趙敏 王玨玉 趙美 邢丹

(哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱，150001) (東北林業(yè)大學)

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CotA漆酶催化靛藍胭脂紅脫色條件優(yōu)化1)

范麗莉 王炎 趙敏 王玨玉 趙美 邢丹

(哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱，150001) (東北林業(yè)大學)

采用Plackett-Burman試驗設計法及響應面分析優(yōu)化了重組細菌漆酶CotA催化靛藍胭脂紅脫色的條件。經(jīng)過Plackett-Burman試驗篩選出影響脫色條件的主要因素為pH、溫度和染料質(zhì)量濃度。利用Box-Behnken中心組合試驗設計及響應面分析，通過三元二次數(shù)學模型進行回歸擬合，預測了靛藍胭脂紅染料最佳脫色條件為：pH=8.6，溫度60 ℃，染料質(zhì)量濃度41.5 mg·L-1，染料在最優(yōu)方案條件下45 min內(nèi)的脫色率實際檢測值為91.40%，與預測值的誤差僅為0.86%。以上結果顯示，CotA漆酶在靛藍胭脂紅脫色領域具有較好的應用前景。對脫色產(chǎn)物進行液相質(zhì)譜分析，檢測到m/z=216.07 [M-Na]-的脫色產(chǎn)物，推測該降解產(chǎn)物為4-氨基-3-羧基苯磺酸鈉，證明CotA漆酶催化靛藍胭脂紅降解。

CotA；靛藍胭脂紅；染料脫色；響應面優(yōu)化

The decolorization of Indigo carmine by the CotA laccase was detected. The decolorization conditions were optimized by the Plackett-Burman test design method and response surface method. The Plackett Burman experiment design was conducted to select the relatively important factors in indigo carmine decolorization. The temperature, pH and concentration of dye were the three significant factors influencing the dye decolorization. Using Box-Behnken center combination experiment design and response surface analysis, the optimal operating condition was with pH of 8.6, 60 ℃ and 41.5 mg·L-1indigo carmine, and the dye decolorization rate was 91.40% within 45 min which was only with 0.86% difference from the forecast value. The results indicated that the promising prospects of the recombinant CotA laccase in indigo carmine decolorization. The molecular ions (m/z=216.07[M-Na]-) were obtained and identified by LC/MS. Therefore, the indigo carmine was degraded to 4-Amino-3-carboxybenzenesulfonic acid sodium salt and the indigo carmine could be degraded by the CotA laccase.

靛藍胭脂紅(IC)是一種應用非常廣泛的靛藍類染料，可用于牛仔褲和其他藍色織物的染色，靛藍胭脂紅還可以作為分析化學中指示劑以及用于顯微鏡觀察的染色劑[1]。此外，靛藍胭脂紅在食品、藥品和化妝品工業(yè)中都有所應用[2]。然而這類靛藍染料可以引發(fā)腫瘤致癌，并可導致生殖、發(fā)育和神經(jīng)性疾病，威脅人體健康[3]，因此脫色降解水體中的靛藍胭脂紅對于減小該染料造成的污染至關重要。目前已有一些利用物理吸附的方法去除廢水中靛藍胭脂紅的報道，使用的吸附材料包括殼聚糖[4]和活性炭[5]等。然而這些物理方法只能從液體中吸附分離染料，還需要繼續(xù)處理才能將染料脫色降解。化學處理需要向染料溶液中加入新的化學成分，這往往會對環(huán)境造成二次污染。酶催化的方法可以加速染料的脫色和分解，效率高且污染小，是一種更加環(huán)保的染料處理方法。利用高效的酶催化靛藍胭脂紅脫色降解將成為減小靛藍胭脂紅污染的重要途徑。

CotA蛋白是一種來源于芽孢桿菌的細菌漆酶，屬于多銅氧化酶家族[6]。水是CotA漆酶催化底物反應的唯一的副產(chǎn)物，因而CotA漆酶是一種典型的“綠色催化劑”。CotA漆酶與其他漆酶相比具有熱穩(wěn)定性高和更加耐堿的特點，更適合處理高溫堿性染料廢水[7]。CotA漆酶催化染料脫色反應受多種因素相互影響，尋找最佳的染料脫色條件對于促進染料脫色降解具有重要意義。本研究探索了CotA漆酶對靛藍胭脂紅染料的脫色能力，并以靛藍胭脂紅的脫色率為響應值，在Plackett-Burman[8-9]試驗和Box-Behnken[10-11]中心組合試驗的基礎上用響應面法對CotA催化靛藍胭脂紅的脫色條件進行優(yōu)化，探究了CotA蛋白催化染料靛藍胭脂紅脫色的最佳條件及各影響因素間的交互作用，為含靛藍胭脂紅廢水的治理提供參考和依據(jù)。利用液相質(zhì)譜對脫色產(chǎn)物分析，證明了CotA對靛藍胭脂紅的降解能力。

1 材料與方法

1.1 CotA漆酶活性的檢測

CotA漆酶的制備方法參見文獻[12]。漆酶單位U定義為在30 ℃、pH=4.6條件下，1 min內(nèi)催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。反應體系為：200 μL酶液、1 mL 3 mmol·L-1的ABTS和1.8 mL pH=4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。以1 mL 3 mmol·L-1的ABTS、2 mL pH=4.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為空白對照。在30 ℃水浴鍋中反應3 min后，測定反應體系420 nm處的吸光度值。酶活力計算公式為：

U=((AV/εDt)/V0)×103。

式中：A為測得的420 nm處吸光度值；V為酶催化反應體系的總體積；ε為ABTS氧化產(chǎn)物在420 nm處的消光系數(shù)(36 000 L·mol-1·cm-1)；D為比色皿的寬度；t為反應時間；V0為加入酶的體積。所有測量均重復3次取平均值。

1.2 CotA漆酶催化靛藍胭脂紅脫色

為證實CotA漆酶催化靛藍胭脂紅脫色的能力，利用光譜儀對含酶和不含酶的靛藍胭脂紅溶液經(jīng)紫外可見光譜掃描。脫色反應體系為20 mL，其中靛藍胭脂紅20 mg·L-1，脫色緩沖液為pH=8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，酶濃度為0.1 U·mL-1。對照溶液不含酶，染料和緩沖液相同。2組溶液在37 ℃條件下振蕩反應，每10 min進行一次光譜掃描。

靛藍胭脂紅的脫色率計算公式為：D=((Ai-At)/Ai)×100%。式中：Ai是脫色前染料溶液610 nm處的吸光度值，At是脫色一定時間后染料溶液610 nm處吸光度值。

1.3 靛藍胭脂紅脫色條件優(yōu)化

1.3.1 Plackett-Burman試驗

通過單因素試驗對pH、溫度、反應時間、酶濃度、染料質(zhì)量濃度5個因子進行篩選，得出參試因素優(yōu)化范圍。每個因素分別取低(-1)和高(+1)2個水平，如表1所示。利用Design-Expert軟件中的Plackett-Burman設計進行12組試驗，每組試驗3次重復取平均值。

表1 Plackett-Burman中各水平因素變量取值

1.3.2 響應面試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，選取3個主要因素(pH、溫度、染料質(zhì)量濃度)進行響應面試驗。根據(jù)Box-Benheken中心組合試驗設計原理，以pH、溫度、染料質(zhì)量濃度作為優(yōu)化因子，每個因子設置3個水平，以(-1、0、1)進行編碼，其中0為中心點，-1和1分別代表相應的低值和高值，如表2所示。以染料脫色率為響應值。中心點試驗重復5次，以估計試驗誤差。通過軟件Design-Expert對響應面試驗結果進行分析，繪制響應面曲線圖和等高線圖，其中響應面曲線圖是在3個試驗因素中固定一個變量(取0水平，即pH=8.5、溫度55 ℃或染料質(zhì)量濃度45 mg·L-1)進行降維分析，得到相應的三維曲面圖。

按照響應面試驗得到的優(yōu)化條件組合進行3次靛藍胭脂紅脫色重復試驗，結果取平均值。將實際的脫色率試驗結果與響應面優(yōu)化的脫色率理論預測值比較，驗證響應面優(yōu)化結果是否與實際相符。

表2 Box-Benheken中各水平變量取值

1.4 染料脫色產(chǎn)物液相色譜質(zhì)譜鑒定

用截留相對分子質(zhì)量為10 000的超濾管將染料降解產(chǎn)物與CotA酶等大分子物質(zhì)分離，收集小分子脫色產(chǎn)物。液相色譜條件為：Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為甲醇和水(50∶50)，柱溫為25 ℃，流速為0.5 mL·min-1。質(zhì)譜檢測為電噴霧離子化方式，選擇負離子模式檢測。

2 結果與分析

2.1 CotA催化靛藍胭脂紅脫色

為驗證CotA漆酶對靛藍胭脂紅溶液的脫色能力，對含CotA和不含CotA的靛藍胭脂紅溶液進行紫外可見光譜掃描，結果如圖1所示。靛藍胭脂紅在可見區(qū)608 nm處有特征吸收峰。不含CotA漆酶的靛藍胭脂紅溶液在pH=8.0的緩沖溶液中穩(wěn)定，震蕩80 min后608 nm處吸光光度值幾乎沒有變化。加入CotA漆酶的染料溶液608 nm處的吸光度值逐漸降低，脫色80 min后幾乎無色，靛藍胭脂紅脫色率達80%。以上結果表明，在CotA漆酶的催化作用下靛藍胭脂紅溶液由藍色逐漸脫色變成無色，靛藍胭脂紅中2個羰基和碳碳雙鍵形成的共軛結構被破壞，CotA漆酶能夠催化靛藍胭脂紅脫色。

圖1 靛藍胭脂紅溶液的紫外可見光譜(間隔10 min)

2.2 影響靛藍胭脂紅脫色的因素

Plackett-Burman試驗設計用于篩選影響靛藍胭脂紅脫色率的主要因素。按表1設計的因素水平，設計了12個試驗點進行靛藍胭脂紅脫色試驗，結果見表3。對表3的數(shù)據(jù)進行方差分析，結果如表4所示。以p<0.01為選擇標準，篩選出3個影響脫色率的顯著因素，分別為pH、溫度和染料質(zhì)量濃度，而反應時間和酶濃度p>0.01，影響不顯著。因此，選擇pH、溫度和染料質(zhì)量濃度3個因素進行后續(xù)染料脫色條件優(yōu)化。

表3 變量的Plackett-Burman試驗編碼值和染料脫色檢測結果

試驗序號pH溫度/℃反應時間/min酶濃度/U·L-1染料質(zhì)量濃度/mg·L-1降解率/%1-1-11-112.612-111-1111.8431-111-138.894-1-1-11-17.20511-1-1-142.016111-1-168.4571-111124.268-1-1-1-1-13.299-11-1118.88101-1-1-114.031111-11140.9212-1111-132.35

表4 Plackett-Burman試驗方差分析結果

2.3 響應面法優(yōu)化靛藍胭脂紅降解條件

利用Expert-desigen軟件用-1、0、1對pH、溫度和染料質(zhì)量濃度這3個顯著影響脫色率的因素進行編碼。靛藍胭脂紅脫色率為響應值。通過Box-Behnken設計對三因素進行優(yōu)化，共17次試驗，其中中心點試驗5次。Box-Behnken試驗設計和相應染料脫色試驗結果如表5所示。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

脫色率=84.590 0+6.360 0X1+6.110 0X2-4.830 0X3-

0.002 5X1X2+0.530 0X1X3-1.300 0X2X3-

該模型的p<0.000 1，差異極顯著，并且失擬項p=0.124>0.050，表明失擬不顯著，說明該方程擬合度很好，方程能很好地描述各因素與脫色率之間的關系。該模型變異系數(shù)為1.81%，低于10%，表明試驗操作可信。信噪比的值通常大于4，說明模型有足夠分辨力。本試驗測得的信噪比為42.631，說明該模型分辨力較好；預測相關系數(shù)0.947 2與校正相關系數(shù)0.99相近，試驗誤差小。該三元二次回歸方程的決定系數(shù)R2=0.995 6，接近1，表明該模型可以解釋99.56%的試驗所得的染料脫色率變化，用該方程預測CotA漆酶對靛藍胭脂紅的脫色是合適的。

表6 Box-Behnken試驗方差分析結果

根據(jù)以上擬合的三元二次回歸方程，利用Design-Expert軟件繪制響應曲面圖及其等高線圖。每個響應面代表了當一個變量處于最佳水平時，另外2個獨立變量之間的相互作用。等高線圖中同一橢圓型的曲線上染料的脫色率是相同的，染料脫色率在橢圓形區(qū)域中心值最高，由中心向邊緣逐漸降低(圖2—圖4)。各圖中反應時間和酶質(zhì)量濃度是固定的，分別為45 min和120 mg·L-1。等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素有交互作用顯著，圓形表示不顯著[13-14]。從等高線可以看出，pH、溫度和染料質(zhì)量濃度對靛藍胭脂紅的降解率存在交互作用。綜合方差分析的結果可知，在所選取的因素水平范圍內(nèi)，各因素對降解率的影響由大到小依次為：pH、溫度、染料質(zhì)量濃度。

圖2 溫度和pH對靛藍胭脂紅脫色率影響的3D響應面(a)和等高線圖(b)

圖3 染料質(zhì)量濃度和pH對脫色率影響的3D響應面(a)和等高線圖(b)

通過擬合方程求出靛藍胭脂紅的脫色最佳條件：pH=8.58，溫度59.97 ℃，染料質(zhì)量濃度為41.4 mg·L-1。該條件下CotA漆酶對靛藍胭脂紅的脫色率理論值為92.2%，考慮到實際操作和試驗儀器的局限性，修正后的最佳工藝條件為：pH=8.6，溫度60 ℃，染料質(zhì)量濃度為41.5 mg·L-1，在此條件下進行了3次重復染料脫色驗證試驗，脫色45 min染料脫色率的平均值為91.4%，與理論值相差較小，說明試驗設計和響應面法優(yōu)化得到的降解脫色工藝參數(shù)準確可靠，與未優(yōu)化之前45 min脫色率61.2%有大幅度提高。

2.4 靛藍胭脂紅脫色產(chǎn)物鑒定

為證明CotA能夠催化染料靛藍胭脂紅降解并鑒定降解產(chǎn)物，對靛藍胭脂紅的脫色產(chǎn)物進行液質(zhì)分析，結果如圖5所示。在負離子檢測模式下檢測到靛藍胭脂紅脫色產(chǎn)物離子峰質(zhì)荷比(m/z)為216.07[M-Na]-，推測該物質(zhì)為4-氨基-3-羧基苯磺酸鈉。目前，對靛藍胭脂紅降解產(chǎn)物的報道較少，有文獻報道靛藍胭脂紅的降解產(chǎn)物是靛紅-5-硫酸鈉[15]。本試驗檢測到靛藍胭脂紅降解的另外一種產(chǎn)物可能是4-氨基-3-羧基苯磺酸鈉。該鑒定結果說明，在CotA漆酶的催化作用下靛藍胭脂紅被降解成小分子化合物，靛藍胭脂紅被催化脫色降解。

圖4 染料質(zhì)量濃度和溫度對脫色率影響的3D響應面(a)和等高線圖(b)

圖5 靛藍胭脂紅脫色產(chǎn)物液相質(zhì)譜

3 結論

CotA漆酶能夠催化靛藍胭脂紅脫色。影響CotA催化靛藍胭脂紅脫色的主要因素為溫度、pH和染料質(zhì)量濃度。對CotA漆酶降解靛藍胭脂脫色條件進行了優(yōu)化，建立了三元二次數(shù)學模型。該模型很好地擬合了靛藍胭脂紅的脫色率與各因素之間的關系。pH、溫度、染料質(zhì)量濃度3因素對脫色率的影響具有交互作用，其對脫色率影響的顯著性由大到小依次為：pH、溫度、染料質(zhì)量濃度。根據(jù)試驗實際情況得出的最優(yōu)降解條件為pH=8.6、溫度為60 ℃、染料質(zhì)量濃度為41.5 mg·L-1，在該條件下靛藍胭脂紅脫色率可達91.4%，與模型預測值接近。CotA漆酶能夠催化靛藍胭脂紅降解生成質(zhì)荷比為216.07[M-Na]-的小分子化合物，靛藍胭脂紅被降解。

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Decolorization Optimization of Indigo Carmine by CotA Laccase//

Fan Lili, Wang Yan(Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, P. R. China); Zhao Min, Wang Jueyu, Zhao Mei, Xing Dan

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CotA； Indigo carmine； Decolouration； Response surface methodology

1)國家核設施及放射性廢物治理科研項目(14ZG6101);科技部基礎性工作專項項目(2014FY210400)。

范麗莉，女，1986年10月生，哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，博士研究生。E-mail：357309136@qq.com。

王炎，哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，教授。E-mail：wangy_msn@hotmail.com。

2016年4月22日。

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責任編輯：程 紅。