楊驥 楊雪 楊潔 李明

200032上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（楊驥、李明）；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科（楊雪）；上海市血液中心（楊潔）

·研究報(bào)道·

羥氯喹對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外分化的調(diào)控作用

楊驥 楊雪 楊潔 李明

200032上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科（楊驥、李明）；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科（楊雪）；上海市血液中心（楊潔）

目的明確羥氯喹對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）體外分化的調(diào)控作用。方法取1例健康人外周血15 ml，分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）后，分選幼稚性T細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF?β）和白細(xì)胞介素2（IL?2）協(xié)同誘導(dǎo)因子體外培養(yǎng)；試驗(yàn)組加入誘導(dǎo)因子及20 μmol/L羥氯喹體外培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第0、6、12天，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢查CD4+Foxp3+Treg的數(shù)量和比例。結(jié)果培養(yǎng)第0、6和12天，對(duì)照組Treg細(xì)胞數(shù)量分別為（2±0.4）× 104、（13.2±5.2）× 104和（143.5±35.9）×104；試驗(yàn)組分別為（2±0.5）×104、（2.4±0.4）×104和（5.6±3.5）×104。第6和12天，兩組CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為3.78、6.16，均P＜0.05）。培養(yǎng)第12天，試驗(yàn)組CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為79.7%±18.1%，對(duì)照組為16%±13%（t=11.77，P＜0.01）。結(jié)論羥氯喹在體外具有抑制CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞增殖和分化的作用。

羥氯喹；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一群具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞，具有維持體內(nèi)免疫平衡的作用［1?3］。研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者Treg數(shù)量減少，功能受損，并與狼瘡病情活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）相關(guān)［4-6］。羥氯喹是目前臨床常用的治療SLE的基本藥物，其對(duì)Treg的調(diào)控作用并不清楚，本研究觀察羥氯喹對(duì)體外Treg分化的調(diào)控作用。

一、試劑、儀器和細(xì)胞

健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（來(lái)源于上海市血液中心），幼稚性CD4+T細(xì)胞分選磁珠（德國(guó)MiltenyiBiotec公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體（美國(guó)BD Pharmingen公司），PE標(biāo)記的Foxp3單克隆抗體（美國(guó)eBioscience公司），羥氯喹（英國(guó)Abcam公司），抗CD3/CD28活化磁珠（Life Dynabeads），轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF?β）和白細(xì)胞介素2（IL?2）（美國(guó)Peprotech公司），流式細(xì)胞儀（FACS?Calibur，美國(guó)BD公司），胎牛血清（美國(guó)Life Invitrogen公司），細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640G（美國(guó)Gibco公司）。

二、方法

1.幼稚性CD4+T淋巴細(xì)胞的分選和鑒定：取1例健康人外周血15 ml，分選外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加入幼稚性T細(xì)胞分選磁珠分選。分選到的幼稚性CD4+T細(xì)胞經(jīng)CD4?FITC單克隆抗體標(biāo)記后，通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定，分選的純度達(dá)95%以上，分選百分率為10%～15%。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)，并簽署知情同意書(shū)。

2.CD4+Treg細(xì)胞的擴(kuò)增及鑒定：對(duì)照組，第0天，將分選到的幼稚性CD4+T細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，加入抗CD3/CD28活化磁珠（5 ml/L）、TGF?β（10 μg/L）和IL?2（20 U/ml）擴(kuò)增。第6、9天半量換液，補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)組，在培養(yǎng)的第0天加入20 μmol/L羥氯喹，第6、9天半量換液，補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子以及羥氯喹。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)3復(fù)孔，每組初始放入等量分選到的幼稚性CD4+T細(xì)胞。部分細(xì)胞在培養(yǎng)第0天和第6天收集細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞用聚丁二酸丁二醇酯（PBS）洗滌1遍，CD4?FITC常溫避光表面染色15 min，PBS洗滌后，加入固定劑固定30 min；用破膜劑洗滌2次后，加入Foxp3-PE抗體染色30 min。PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞分化數(shù)量比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析都在SPSS15.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行。

三、結(jié)果

1.羥氯喹對(duì)體外CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞分化數(shù)量的影響：體外誘導(dǎo)幼稚性T細(xì)胞向Treg誘導(dǎo)分化6 d后，CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量增多，培養(yǎng)至12 d增多更明顯。而實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)第6天和第12天CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量增加受到明顯抑制，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.羥氯喹對(duì)體外CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞分化比例的影響：體外誘導(dǎo)幼稚性T細(xì)胞向Treg分化前CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞比例為1.23%±0.1%，誘導(dǎo)12 d后對(duì)照組為79.7%±18.1%，試驗(yàn)組為16.0%± 6.1%（圖1），兩組比較，t=11.77，P＜0.01。

四、討論

羥氯喹治療SLE的主要機(jī)制為減低皮膚對(duì)紫外線的敏感性，穩(wěn)定溶酶體膜，抑制變性DNA與抗體結(jié)合，抑制細(xì)胞免疫和補(bǔ)體活性［7-8］。

我們的研究表明，體外羥氯喹不僅能時(shí)間依賴地抑制幼稚性T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，減少Treg細(xì)胞擴(kuò)增的數(shù)量，也抑制了Fox3+Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例，表明羥氯喹在體外對(duì)Treg的分化和增殖具有抑制作用。推測(cè)羥氯喹在治療SLE的過(guò)程中并不是通過(guò)促進(jìn)Treg的分化，而可能是通過(guò)其他途徑抑制免疫炎癥。

盡管本研究提示，羥氯喹對(duì)體外Treg分化和增殖具有抑制作用，但我們研究時(shí)采用的是20 μmol/L羥氯喹，其主要依據(jù)臨床羥氯喹200 mg/d的等效劑量換算，其他劑量的羥氯喹對(duì)Treg分化的影響作用有待進(jìn)一步研究并明確。此外本研究結(jié)果提示，羥氯喹抑制幼稚性T細(xì)胞向Treg分化，而羥氯喹對(duì)成熟Treg的分化和增殖的影響也有待進(jìn)一步明確。

表1 羥氯喹干預(yù)體外誘導(dǎo)幼稚性T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化后不同時(shí)間CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的變化（x± s，× 104）

圖1 羥氯喹對(duì)體外CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞分化影響的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

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Regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells

Yang Ji,Yang Xue,Yang Jie,Li Ming
Department of Dermatology,Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai 200032,China（Yang J,Li M）;Department of Rheumatology,Huashan Hospital,Fudan University（Yang X）;Shanghai Blood Center,Shanghai 200051,China（Yang J）

ObjectiveTo evaluate the regulatory effect of hydroxychloroquine onin vitrodifferentiation of regulatory T cells（Treg）.MethodsFifteen milliliters of peripheral blood were obtained from a healthy human subject followed by isolation of monouclear cells and sorting of naive T cells.Then,the naive T cells were classified into two groups:control group cultured with the presence of tumor growth factor（TGF）?β and interleukin（IL）?2,experimental group cultured with the presence of 20 μmol/L hydroxychloroquine and inducing factors.The number and percentage of CD4+Foxp3+Treg cells were determined by flow cytometry at days 0,6,and 12.ResultsThe number of Treg cells at days 0,6,and 12 were（2 ± 0.4）× 104,（13.2 ± 5.2）× 104,and（143.5 ± 35.9）× 104respectively in the control group,（2± 0.5）× 104,（2.4± 0.4）×104,and（5.6±3.5）× 104respectively in the experimental group.There was a significant difference in the number of CD4+Foxp3+Treg cells between the two groups at days 6 and 12（t=3.78 and 6.16,respectively,bothP＜0.05）.At day 12,the percentage of CD4+Foxp3+Treg cells was 79.7% ±18.1%in the experimental group,compared to 16% ± 13%in the control group（t=11.77,P＜ 0.01）.ConclusionHydroxychloro?quine could inhibit the differentiation and proliferation of CD4+Foxp3+Treg cellsin vitro.

Hydroxychloroquine;T?lymphocytes,regulatory;Cell proliferation;Cell differentiation

Li Ming,Email:li.ming@zs?hospital.sh.cn

李明，Email：li.ming@zs?hospital.sh.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.07.014

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472874、81401346）；上海市科委醫(yī)學(xué)類引導(dǎo)項(xiàng)目（134119a8400）；2014年上海市青年醫(yī)師培養(yǎng)計(jì)劃；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院優(yōu)秀骨干計(jì)劃（2015ZSYXGG13）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81472874，81401346）,Medical Guide Project of Shanghai Municipal Science and Technology Commission（134119a8400）;Shanghai Municipal Cultivation Plan for Youth Physicians in 2014;Outstanding Talent Plan of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University（2015ZSYXGG13）

2015?09?23）

（本文編輯：顏艷）