單思聰，孫爽

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

超臨界萃取多穗柯黃酮及其抗運(yùn)動(dòng)氧化功能研究

單思聰，孫爽

（吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平136001）

采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化超臨界CO2萃取多穗柯黃酮工藝，并研究多穗柯黃酮對大鼠超氧化物歧化酶活力（SOD）、谷胱甘肽活力（GSH）及丙二醛（MDA）水平的影響。結(jié)果表明：最佳工藝參數(shù)為夾帶劑添加量3.0 mL/g、萃取壓力25 MPa、萃取溫度30℃、萃取時(shí)間180 min，此工藝參數(shù)下所得黃酮含量為10.95%，與普通提取法相比黃酮含量提高1.51%。大鼠試驗(yàn)表明，與正常對照組相比，多穗柯黃酮組SOD、GSH明顯升高，MDA水平明顯下降，說明多穗柯黃酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。

多穗柯；黃酮；超臨界萃?。豢寡趸?/p>

多穗柯（Lithocarpus polystarch）俗稱甜茶，是殼斗科櫟屬作物，屬于藥食同源物質(zhì)［1-2］，同時(shí)兼茶、藥、糖三種功效，在我國屬于傳統(tǒng)民間藥材，具有保健功能。多穗柯葉中具有大量的黃酮類成分［3-5］。近幾年，黃酮類物質(zhì)研究相對較多，究其原因可能是此類物質(zhì)有降血糖、降血脂以及消除體內(nèi)自由基、抗氧化等多重功效，提取多穗柯黃酮對開發(fā)運(yùn)動(dòng)員食用的保健品具有重要意義［6-7］。

目前有多種方法可用來提取多穗柯黃酮，如水提法、乙醇法、微波法、超聲波法等，超臨界CO2萃取多穗柯黃酮的研究還未見報(bào)道。與常規(guī)的提取法相比，超臨界CO2萃取屬于高新技術(shù)［8-10］，具有分離效率高、無污染、天然成分不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)［11-12］。為進(jìn)一步提高多穗柯黃酮提取物中黃酮含量，本試驗(yàn)采用超臨界CO2萃取多穗柯黃酮，并用正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝，優(yōu)化出最佳工藝參數(shù)。并研究多穗柯黃酮的抗運(yùn)動(dòng)氧化功能，為開發(fā)多穗柯黃酮類保健食品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

多穗柯：陜西浩洋生物科技有限公司。

NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、無水乙醇：匯普試劑有限公司；蘆丁（純度＞95%）：西安貝拉生物科技有限公司。

Wistar大鼠：體質(zhì)量130 g～150 g，雄性，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK-（吉）2008-0005，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2儀器與設(shè)備

Speed SFE型超臨界二氧化碳萃取儀：美國Applied Separations公司；754N型紫外可見分光光度計(jì)：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；JS-30S電子計(jì)數(shù)秤：深圳市盛美儀器有限公司；SHA-CA往復(fù)數(shù)顯水浴振蕩器：常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；HS-DZG-6050SA型真空干燥箱：上海和晟儀器科技有限公司；I-Ce100型離心機(jī)：上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（批號(hào)：20100322）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（批號(hào)：20100324）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）測定試劑盒（批號(hào)：20100325）：上海紀(jì)寧生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1超臨界萃取多穗柯黃酮工藝流程

取一定量的多穗柯，將其洗凈，然后放入烘箱中烘干，取出后粉碎至100目，得多穗柯粉，加入超臨界設(shè)備萃取釜中，根據(jù)單因素及正交試驗(yàn)預(yù)設(shè)的壓力、溫度、時(shí)間等條件進(jìn)行超臨界萃取，在分離釜中得黃酮，進(jìn)行測定。

1.3.2多穗柯黃酮含量測定

利用紫外可見分光光度計(jì)對蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于510 nm處進(jìn)行掃描，能夠得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=8.621 3C+0.002 8（R2=0.999 8），其中C為黃酮濃度（g/L），A為吸光度值。1 mL待測液體，利用無水乙醇將其稀釋為5 mL，混合后再加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，靜置5 min，再加0.3 mL 10%Al（NO3）3溶液，靜放6 min，再加4 mL 1 mol/LNaOH溶液及0.4 mL 30%乙醇溶液，混勻后靜置10 min，于510 nm下測定其吸光度，根據(jù)吸光度可得出黃酮的濃度。

1.3.3超臨界萃取多穗柯黃酮單因素試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，取夾帶劑添加量［2.5、3.0、3.5、4.0、4.5（mL/g）］、萃取壓力（20、25、30、35、40 MPa）、萃取溫度（25、30、35、40、45℃）、萃取時(shí)間（120、150、180、210、240 min）作為因素，每個(gè)因素取5個(gè)水平，測定各因素對多穗柯總黃酮含量的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)對多穗柯黃酮超臨界萃取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　因素與水平Table 1Factors and levels

1.3.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

取雄性Wistar大鼠30只，喂養(yǎng)8 d后，隨機(jī)分為正常對照組（Z組），高脂飼料組（G組），多穗柯黃酮組30 mg/（kg·d）組（HT組），每組10只大鼠，正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飼料組給予高脂飼料喂養(yǎng)，多穗柯黃酮組給普通飼料喂養(yǎng)后還需按規(guī)定劑量注射多穗柯黃酮喂養(yǎng)，Z組和G組注射同體積生理鹽水，每日1次，持續(xù)8周，待測，末次訓(xùn)練和喂食后，禁食12 h，麻醉處理，腹主動(dòng)脈進(jìn)行取血，分離血清，檢測SOD活力、GSH活力以及MDA水平［13-16］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用PASW Statistics 17.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件，多組之間采用單因素方差分析比較，組間比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示［17］。

2　結(jié)果與分析

2.1超臨界萃取多穗柯黃酮單因素試驗(yàn)

2.1.1夾帶劑添加量對多穗柯黃酮提取效果的影響

夾帶劑添加量對多穗柯黃酮提取效果的影響見圖1。

圖1　夾帶劑添加量對黃酮含量的影響Fig.1Effect of amount of entrainer on flavonoids yield

由圖1可知，當(dāng)夾帶劑添加量為2.5 mL/g時(shí)，黃酮含量較小，隨著夾帶劑添加量的增大，黃酮含量逐漸提高，原因可能是隨著夾帶劑添加量的提高，能夠進(jìn)一步提出黃酮，而夾帶劑達(dá)到3.5 mL/g時(shí)，黃酮含量不再繼續(xù)增大，說明夾帶劑對黃酮含量提高有效果，但有極限溶解度，所以選擇夾帶劑添加量3、3.5、4 mL/g為多因素研究水平。

2.1.2萃取壓力對多穗柯黃酮提取效果的影響

萃取壓力對多穗柯黃酮提取效果的影響見圖2。

由圖2可知，隨著萃取壓力的增大，黃酮含量逐漸提高，當(dāng)萃取壓力為30 MPa時(shí)，黃酮含量最高，繼續(xù)增大萃取壓力，黃酮得率下降。原因可能是萃取壓力過大，超臨界流體破壞了黃酮分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致黃酮含量減小。因此選擇25、30、35 MPa為多因素研究水平。

圖2　萃取壓力對黃酮含量的影響Fig.2Effect of extraction pressure on flavonoids yield

2.1.3萃取溫度對多穗柯黃酮提取效果的影響

萃取溫度對多穗柯黃酮提取效果的影響見圖3。

圖3　萃取溫度對黃酮含量的影響Fig.3Effect of extraction temperature on flavonoids yield

由圖3可知，多穗柯黃酮含量隨著萃取溫度的升高而增大，當(dāng)萃取溫度達(dá)到35℃時(shí)，黃酮含量最大，繼續(xù)升高溫度，黃酮含量下降，原因可能是溫度過高后破壞了黃酮分子的結(jié)構(gòu)致使黃酮含量減少。因此選擇30、35、40℃為多因素研究水平。

2.1.4萃取時(shí)間對多穗柯黃酮提取效果的影響

萃取時(shí)間對多穗柯黃酮提取效果的影響見圖4。

圖4　萃取時(shí)間對黃酮含量的影響Fig.4Effect of extraction time on flavonoids yield

根據(jù)圖4，當(dāng)萃取時(shí)間為120 min時(shí)，黃酮含量最低，隨著萃取時(shí)間的延長，黃酮含量上升，當(dāng)萃取時(shí)間達(dá)到180 min后，繼續(xù)延長時(shí)間，黃酮含量幾乎不變，原因可能是通過超臨界萃取，黃酮已幾乎完全被提出，故繼續(xù)延長萃取時(shí)間不會(huì)提高黃酮含量，因此選擇萃取時(shí)間150、180、210 min為多因素研究水平。

2.2超臨界萃取多穗柯黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

利用軟件SPSS16.0對本試驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2和表3。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Orthogonal test results

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3Variance analysis of orthogonal array design experimental results

由表3可以看出，夾帶劑添加量、萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間對超臨界萃取多穗柯黃酮含量的影響均極顯著。各因素對多穗柯黃酮含量影響大小依次為是萃取壓力＞萃取溫度＞夾帶劑添加量＞萃取時(shí)間，根據(jù)表2可知，最優(yōu)試驗(yàn)方案是A1B1C1D2，也即工藝條件為夾帶劑添加量3.0 mL/g、萃取壓力25 MPa、萃取溫度30℃、萃取時(shí)間180 min。由于A1B1C1D2不在9組試驗(yàn)中，對A1B1C1D2進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其黃酮含量平均為10.95 mg/g，為最高，故A1B1C1D2為最優(yōu)組合。

2.3多穗柯黃酮對大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影響

多穗柯黃酮對大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影響如表4所示。

表4　多穗柯黃酮對大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影響（±s，n=10）Table 4Effect of Lithocarpus flavonoids on SOD，MDA and GSH in rats（x±s，n=10）

表4　多穗柯黃酮對大鼠SOD、GSH活性及MDA含量的影響（±s，n=10）Table 4Effect of Lithocarpus flavonoids on SOD，MDA and GSH in rats（x±s，n=10）

GSH活力/（U/mL）Z組89.57±3.145.86±0.394.21±0.54 G組64.76±3.727.59±0.573.65±0.76 HT組3098.93±5.345.24±0.404.95±0.41組別劑量/［mg/（kg·d）］SOD活力/（U/mL）MDA含量/（nmol/L）

由表4可知，與Z組比較，G組大鼠MDA含量明顯升高（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明顯降低（P＜0.001）。HT組大鼠MDA含量明顯下降（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明顯升高（P＜0.001）。與G組比較，HT組大鼠MDA含量明顯下降（P＜0.001），SOD活力、GSH活力明顯升高（P＜0.001）。SOD作為體內(nèi)極其重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑，對機(jī)體氧化平衡至關(guān)重要，其活性的高低能夠反映機(jī)體抗氧化能力；MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，它能阻礙細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及通透性，使細(xì)胞功能遭到破壞，能反映出機(jī)體過氧化物水平。GSH也能清除體內(nèi)自由基，抗氧化，并能與體內(nèi)毒物結(jié)合，加速代謝。通過本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，能夠得出，與Z組比較，HT組SOD活力及GSH活力明顯升高，MDA水平明顯下降，說明多穗柯黃酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。綜上所述，多穗柯黃酮具有一定的抗氧化作用。

3　結(jié)論

1）通過單因素和正交試驗(yàn)?zāi)軌騼?yōu)化超臨界法提取多穗柯黃酮工藝，最佳工藝條件為夾帶劑添加量3.0 mL/g、萃取壓力25 MPa、萃取溫度30℃、萃取時(shí)間180 min，此工藝參數(shù)下黃酮含量為10.95%，與普通提取法相比提取率提高1.51%。各因素對多穗柯黃酮提取率的影響由大到小為萃取壓力＞萃取溫度＞夾帶劑添加量＞萃取時(shí)間。

2）通過大鼠試驗(yàn)表明，與正常對照組相比，多穗柯黃酮組SOD活力、GSH活力明顯升高，MDA水平明顯下降，說明多穗柯黃酮可有效提高大鼠抗氧化能力，并且具有清除自由基的作用。

［1］李勝華，伍賢進(jìn)，郁建平，等.多穗柯總黃酮提取工藝及其含量動(dòng)態(tài)變化研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（6）：139-141

［2］李勝華，伍賢進(jìn)，牛友芽.HPLC測定多穗柯中二氫查耳酮含量研究［J］.食品科技，2010，35（6）：281-283

［3］張毅，寧正祥，董華強(qiáng).多穗柯三葉苷的抑制糖尿病關(guān)鍵酶活性和抗氧化性［J］.食品科學(xué)，2011，32（5）：32-35

［4］張毅.多穗柯黃酮異戊烯改性及性質(zhì)研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2011

［5］Hou Shao-Zhen，Chen Shu-Xian，Huang Song，et al.The hypoglycemic activity of Lithocarpus polystachyus Rehd.leaves in the experimental hyperglycemic rats.［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，24（2）：120-124

［6］Qian-Wen Wang，Jia-Jia Liu，Xiong.Purification of phloridzin from Lithocarpus polystachyus Rehd leaves using polymeric adsorbents functionalized with glucosamine and β-cyclodextrin［J］.Chemical Papers，2014，11（7）：32-35

［7］Huaqiang Dong，Zhengxiang Ning，Lijing Yu.Preparative Separation and Identification of the Flavonoid Phlorhizin from the Crude Extract of Lithocarpus Polystachyus Rehd［J］.Molecules，2007，123（32）：65-69

［8］樊紅秀，劉婷婷，劉鴻鋮，等.超臨界萃取人參皂苷及HPLC分析［J］.食品科學(xué)，2013，34（20）：121-126

［9］任飛，韓發(fā)，石麗娜，等.超臨界CO2萃取技術(shù)在植物油脂提取中的應(yīng)用［J］.中國油脂，2010，35（5）：14-19

［10］萬楚筠，胡雙喜，李文林，等.超臨界CO2萃取脫皮菜籽餅粕油脂的可行性［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2014，30（9）：272-278

［11］高蔭榆，游海，陳芩，等.蜂膠黃酮類化合物超臨界萃取工藝研究［J］.食品科學(xué)，2002，23（8）：154-157

［12］樊文樂，武文潔.超臨界萃取中夾帶劑的概述［J］.食品科技，2005，13（2）：39-42

［13］楊娜，王鴻飛，許鳳，等.蕨麻多糖提取及抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（2）：60-66

［14］李洋，馬文平，倪志婧.寧夏枸杞體外抗氧化機(jī)理研究［J］.食品科學(xué)，2014，35（1）：79-84

［15］王曉宇，杜國榮，李華.抗氧化能力的體外測定方法研究進(jìn)展［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，31（3）：247-252

［16］陳潔，胡曉赟.蛋白水解物的抗氧化性研究與展望［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2011，11（9）：111-119

［17］張蓮婷.麥冬藥材資源品質(zhì)評價(jià)［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009

Study on the Supercritical Extraction Flavonoids from Lithocarpus and Its Anti-oxidation Effect

SHAN Si-cong，SUN Shuang
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Single factor and orthogonal experiment of supercritical CO2extraction of flavonoids from Lithocarpus and study on effect of flavonoids on rats SOD，GSH，MDA levels.The result showed：the optimum parameters as entraineramountof3.0mL/g，extractionpressure25MPa，extractiontemperature30℃，extractiontime180 min，Under this parameter Flavonoids was 10.95%，compared with ordinary extraction flavonoid content increased 1.51%.Rat test showed that，compared with normal control group，Lithocarpus flavonoid group SOD，GSH increased significantly，MDA levels were significantly decreased，indicating Lithocarpus flavonoids could improve the antioxidant capacity in rats，and had the effect of free radical scavenging.

lithocarpus；flavonoids；supercritical extraction；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.017

單思聰（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：體育教育研究。

2016-03-07