顏　華，何　姣，李素儉，賈良輝，李軍超

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

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丹參植株內(nèi)生菌的分離純化及其抗病性研究

顏華，何姣，李素儉，賈良輝，李軍超*

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

為探明丹參(SalviamiltiorrhizaBge)內(nèi)生菌的種類，篩選拮抗農(nóng)作物病害菌的生防菌株，從健康丹參植株中進行內(nèi)生菌分離，依照形態(tài)特征以及16S rDNA序列對菌株進行初步分類鑒定，采用瓊脂塊法進行拮抗菌株篩選，并選取拮抗活性較強的菌株液體發(fā)酵進行體外抑菌試驗。結(jié)果表明：(1)從丹參植株中共分離得到69株內(nèi)生菌(真菌62株、放線菌7株)，其中23株內(nèi)生真菌屬于無孢類群或現(xiàn)有條件不適合產(chǎn)孢，其余真菌菌株中串珠鐮孢菌屬(FusariummoniliformeSheld.)和交鏈孢菌屬(Alternariasp)為優(yōu)勢菌群；7株內(nèi)生放線菌均為鏈霉菌屬。(2)病原菌拮抗性實驗表明，有 44株內(nèi)生菌對病原菌具有不同程度的拮抗活性，其中12株內(nèi)生菌對2種及以上靶標病原菌具有拮抗活性，表明丹參內(nèi)生菌具有一定的廣譜抗菌性。(3)放線菌菌株A232的次級代謝產(chǎn)物對白色假絲酵母(Canidiaalbicans)和蘋果腐爛菌(Valsamali)都表現(xiàn)出較強的拮抗活性，通過形態(tài)、培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列分析，鑒定其為Streptomycesluteoverticillatus。

內(nèi)生菌；丹參；分離；拮抗性

鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge)為多年生草本植物，作為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，也是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的主要中藥之一[1]，主要被用于治療心腦血管疾病，同時還用于治療肝纖維化、消化性潰瘍、白內(nèi)障、癌癥、記憶缺失、艾滋病等疾病[2]。自20世紀30年代起，國內(nèi)外學(xué)者先后分離得到了丹參藥用有效成分，包括脂溶性的丹參酮Ⅰ、ⅡA、隱丹參酮等及水溶性的丹參素、原兒茶醛、丹酚酸等[3]。近年來，由于市場上日益增大的丹參需求量，野生丹參轉(zhuǎn)為人工家種的栽培面積也日益增大，對于病蟲害的防治也愈發(fā)重要[4]。研究表明多種病原菌可導(dǎo)致栽培丹參病害的發(fā)生，目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥防治，但防效甚微[5]。利用土壤有益微生物菌劑，快速恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡是解決中藥材土傳病害的最佳選擇[6]。

近年來有關(guān)研究表明，從植物的根、莖、葉、果實等中分離到了很多以前未被人們認識的植物內(nèi)生菌(endophyte)[7]，內(nèi)生菌通過多種方式協(xié)助宿主抵御病蟲害的入侵[8]，如促進其新陳代謝[9]，與病原菌資源競爭，以及合成一些對其有毒害作用的次級代謝產(chǎn)物[10]。此外，對藥用植物而言，由于其內(nèi)生菌與其“協(xié)同進化”的關(guān)系，決定了某些內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)的能力[11]。我們對本校試驗地內(nèi)丹參植株進行了內(nèi)生菌的分離、培養(yǎng)與鑒定，并對其進行抗病原菌活性進行研究，以期開發(fā)新的微生物資源，提高丹參的產(chǎn)量及質(zhì)量。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1丹參植株采集用于進行內(nèi)生菌分離的丹參植株均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗地的2年生丹參植株，分別取新鮮健康植株的根、莖和葉，采集的樣品4 h內(nèi)進行內(nèi)生菌的分離。

1.1.2供試病原菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白假絲酵母(Candidaalbicans)和蘋果腐爛菌(Valsamali)由微生物實驗室提供。

1.1.3培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；高氏一號培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；淀粉水解培養(yǎng)基；Tresner 培養(yǎng)基；酪氨酸培養(yǎng)基；肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基；明膠液化培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生菌的分離純化取新鮮、無蟲害的丹參植株，經(jīng)流水沖洗后，對材料表面進行消毒，先用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3～4次，再在0.1%升汞中浸泡5 min，用無菌水沖洗3～4次。處理完畢在無菌條件下，用滅菌剪刀將葉片剪成5 mm×5 mm大小，根和莖切成長2 mm小段，接種到PDA和高氏一號固體培養(yǎng)基上，28 ℃避光培養(yǎng)2～3 d，待其邊緣長出菌絲，用接種針挑取邊緣生長良好的菌絲反復(fù)純化，重復(fù)至得到純種。

1.2.2內(nèi)生菌的初步鑒定采用插片法[12]進行形態(tài)特征觀察，于第4、9天取片，光學(xué)顯微鏡下鏡檢拍照，記錄形態(tài)特征；同時記錄培養(yǎng)特征(基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的特征及顏色)。內(nèi)生真菌的鑒定依照《真菌鑒定手冊》[13]進行。

1.2.3內(nèi)生拮抗菌的初篩通過平板涂抹法將供試菌接于改良高氏一號平板上培養(yǎng)10 d，用瓊脂塊法[14]進行拮抗性試驗。細菌培養(yǎng)2 d，真菌培養(yǎng)3 d，測定、記錄拮抗圈的大小。從中選出拮抗性強的菌株在液體培養(yǎng)基中接種，28℃ 170 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，用無菌濾紙片蘸取發(fā)酵液后放入涂有病原菌的平板上。每皿3重復(fù)，28℃培養(yǎng)。

1.2.4菌株232的分類鑒定(1)形態(tài)、培養(yǎng)特征取在高氏一號上培養(yǎng)7 d的232菌株的菌落邊緣的菌塊，大小為5 mm×5 mm×2 mm，置4%戊二醛中，4 ℃冰箱過夜進行固定；用pH 6.8的PBS緩沖液沖洗4～6次，每次30 min；然后用系列丙酮脫水，每次30 min；再用醋酸異戊酯置換2次；最后將樣品置于CO2干燥器中進行臨界點干燥，粘臺，噴金后觀察菌絲形態(tài)并照相[15-16]。

(2)16S rDNA序列測定及系統(tǒng)進化分析CTAB法提取菌株DNA。16S rRNA序列PCR擴增引物為細菌通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增產(chǎn)物送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank中進行Blast，選取與目標菌株相似性較近的菌株序列，使用Clustal X(1.81)軟件進行aligment；利用MEGA5.0軟件對計算后的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建進化樹(N-J法，Bootstrap重復(fù)100次，Kimura-2- parameter)[17]。

2　結(jié)果與分析

2.1丹參植株內(nèi)生菌的分離結(jié)果

從健康丹參植株中共分離得到69株內(nèi)生菌，其中包括62株內(nèi)生真菌和7株內(nèi)生放線菌。62株真菌中有51株分離自葉片，11株分離自莖部，其中多達23株屬于無孢類群(也可能是現(xiàn)有的條件不適合其產(chǎn)孢)，占37.10%。其余內(nèi)生真菌菌株中串珠鐮孢菌屬和交鏈孢菌屬各有17株，為優(yōu)勢菌，分別占27.42%，青霉屬有5株，只占8.06%；7株內(nèi)生放線菌中有5株是由根部分離得到，莖部和葉片各分離到1株，根據(jù)16S相似性均歸到鏈霉菌屬(表1)。

2.2病原菌拮抗性內(nèi)生菌的初篩

為了篩選到可能的生防菌株，我們對所分離到的內(nèi)生菌進行了病原菌的拮抗實驗，結(jié)果見表2。由表2可以看出， 69株丹參內(nèi)生菌中有44株針對不同靶標菌有一定的拮抗活性，占內(nèi)生菌總數(shù)的70.97%，其中：拮抗大腸桿菌的菌株數(shù)量最多，有22株，拮抗蘋果樹腐爛病菌的次之，有12株；菌株211-50Z、2BYLF11、3CYLF07、A232對3種及以上靶標菌具拮抗活性，8株內(nèi)生菌對2種靶標病原菌具有抗性，表明丹參內(nèi)生菌具有一定的廣譜抗性。另外，菌株231-50Z和2BYRF05分別對假絲酵母和蘋果樹腐爛病菌的抑菌圈直徑均達25 mm，表明丹參內(nèi)生菌對病原菌具有較強的拮抗效果。

表1　丹參內(nèi)生菌類群組成Table 1　The composition of endophytic strains fromSalvia miltiorrhiza

表2　供試菌的初篩試驗結(jié)果(抑菌圈直徑)Table 2　The inhibiting effect of strains studied on pathogens (bacteriostatic diameter/mm)

2.3丹參內(nèi)生菌發(fā)酵液對病原菌的拮抗性實驗結(jié)果

根據(jù)初篩結(jié)果，選取抗性較強，抑菌譜較廣的15株內(nèi)生菌進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，對發(fā)酵液的抑菌活性進行了測定。其中2BYLF11、211-50Z、3CYLF07、A232四株內(nèi)生菌的抑菌效果較好(表3)，它們多能對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌產(chǎn)生顯著的拮抗作用。2BYLF11發(fā)酵液對大腸桿菌以及211-50Z對金黃葡萄球菌的抑制直徑可達20 mm；此外，2BYLF11發(fā)酵液還可對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)較強的拮抗作用；211-50Z和A232發(fā)酵液對白假絲酵母，以及A232發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病病菌也有較為明顯的拮抗作用。

相對于固體培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出病原菌拮抗活性的丹參內(nèi)生菌株數(shù)目較少，且某些菌株發(fā)酵液的抑菌譜與其固體培養(yǎng)時不一致，如3CYLF07固體培養(yǎng)基可以拮抗白色假絲酵母，而發(fā)酵液卻對白色假絲酵母沒有拮抗活性，2BYLF11固體培養(yǎng)條件下和液體發(fā)酵液均可以抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌，但對白色假絲酵母和金黃色葡萄菌的拮抗性則分別只在固體培養(yǎng)條件下和液體發(fā)酵條件下實現(xiàn)，這是由于微生物次級代謝受到細胞內(nèi)外信號嚴格的調(diào)控，培養(yǎng)基成分的不同或培養(yǎng)條件的差異會影響到其抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生或產(chǎn)量。

2.4丹參內(nèi)生菌菌株A232的鑒定

2.4.1菌株A232的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征鑒于菌株A232具有較為光譜的抑菌活性且活性較強，我們對其進行了進一步的鑒定。形態(tài)特征和培養(yǎng)特征見圖1。由圖1可見，菌株A232在高氏一號培養(yǎng)基上氣生菌絲和孢子絲豐富，生長良好。顯微鏡下觀察，孢子鏈較長，波曲；孢子圓或者橢圓。

2.4.2菌株A232的16S rDNA序列分析PCR擴增菌株A232的16S rDNA序列并進行測序，利用Blast軟件從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中搜索出的相關(guān)放線菌菌株的16S rDNA序列。隨后用BioEdit進行多序列比對，并利用MEGA3.1的鄰接法進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。將其與GenBank等數(shù)據(jù)庫的該屬的相關(guān)菌株16S rDNA序列進行比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。

由圖2可見，在鏈霉菌屬中，A232與黃化輪毛鏈霉菌(Streptomycesluteoverticillatus)在一個分枝，它們關(guān)系最近(一致性為99.4%)，根據(jù)《放線菌系統(tǒng)學(xué)》[18]的統(tǒng)計，16S rDNA序列一致性在99%以上，有50%的可能性是同種，因此可以把A232暫定為S.luteoverticillatus。

表3　供試菌的發(fā)酵液拮抗結(jié)果(抑菌圈直徑)Table 3　The inhibiting effect of fermentation (bacteriostatic diameter/mm)

圖1　菌株A232的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征Fig.1　Cultural and morphological characteristics of A232

圖2　菌株A232基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree of strain A232 based on 16S rDNA

3　討　論

藥用植物內(nèi)生菌作為寶貴的微生物資源庫，近年來越來越引起研究者們的關(guān)注，關(guān)于藥用植物內(nèi)生菌的多樣性的研究日益增多。對丹參這一重要中藥材內(nèi)生菌的相關(guān)研究也陸續(xù)有報道。唐坤等從河南產(chǎn)區(qū)的丹參中分離到277 株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定，優(yōu)勢菌群主要有鏈格孢屬(Alternaria)、木霉屬(Trichoderma) 和(Cryptosporiopsis)[19]; 冀玉良等[20]從商洛丹參根、莖、葉組織中分離獲得126 株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定歸屬于5 目7 科19屬，曲霉屬(Aspergillus) 和青霉屬(Penicillium)既是整個植株的優(yōu)勢菌群，也是根部和莖部的優(yōu)勢菌群。李艷玲等[21]從泰山產(chǎn)的白花丹參和紫花丹參根、莖、葉和花組織中分離出53 株內(nèi)生真菌，分屬于9 屬，分布最廣的類群是鏈格孢屬(Alternaria) ，占總菌株的43.4%; 其次是Leptodontidiumsp(13.2%) 和鐮刀菌屬(Fusarium) (11.3%)。本實驗從本校試驗地丹參植株得到的62株內(nèi)生真菌中，無孢類群菌株占37.10%；其余菌株中串珠鐮孢菌屬和交鏈孢菌屬為優(yōu)勢菌，各占27.42%，青霉屬的較少，只占8.06%；這說明不同產(chǎn)地的丹參植株中的內(nèi)生真菌具有一定的共性和多樣性。我們還分離得到7株內(nèi)生放線菌，而關(guān)于丹參內(nèi)生放線菌這方面報道目前還很少。從抑菌活性來看，丹參內(nèi)生菌中多數(shù)對病原菌具有程度不等的拮抗活性，部分菌株具有較廣且較強的抑菌活性，有待進一步開發(fā)利用。丹參拮抗內(nèi)生菌的分離，為丹參病害的生物防治奠定了菌種基礎(chǔ)。內(nèi)生菌資源庫的擴充，生防菌活性成分的分離純化等值得進一步研究，以期可以開發(fā)良好的生防產(chǎn)品。

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(編輯:潘新社)

Isolation and Anti-microbial Activity of Endophytes fromSalviamiltiorrhiza

YAN Hua，HE Jiao，LI Sujan，JIA Lianghui, LI Junchao*

(College of Life Sceinces，Northwest A&F University，Yangling, Shaanxi 712100，China)

The objective of this research was to explore the population diversity, distribution features and the antibacterial activity of endophytes ofSalviamiltiorrhizaBge. 69 strains were isolated from the tissue of RadixSalviamiltiorrhizaBge，which were composed of 62 endophytic fungis and 7 endophytic actinomycetes．They were identified according to morphology and 16s rDNA．The antagonistic activities of the endophytes and some of their secondary metabolites against pathogens were also carried out. The results showed that: (1)FusariummoniliformeSheld. andAlternariasp were the dominant genera among endophytes fromSalviamiltiorrhiza; (2) 44 strains presented antagonistic to pathogenic bacterium or fungi, among of which，50% show antifungal activity onEscherichiacoli; Some endophytes had the strongest bacteriostatic activities onStaphylococcusaureusandCandidaalbicans，the biggest diameter of antagonism could be 25 mm; (3) The secondary metabolites of strain A232 presented strong and broad-spectrum and antagonistic activity toC.albicansandValsamali. Based on morphology and 16S rDNA sequence, strain A232 was identified asStreptomycesluteoverticillatus.

endophytes；Salviamiltiorrhiza；isolation；antagonism

1000-4025(2016)09-1813-06doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1813

2016-06-22;修改稿收到日期:2016-08-30

國家自然科學(xué)基金(31101476);2012年度高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120204120042);西北農(nóng)林科技大學(xué)引進人才專項(Z111021104);楊凌示范區(qū)科技計劃項目(2014NY-41)

顏 華(1976-)，女，博士，副教授，主要從事微生物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：yanh99@gmail.com

李軍超，副教授，主要從事藥用植物種質(zhì)資源保存與優(yōu)良品系選育，植物細胞工程等研究。E-mail：lijunchao57@sohu.com

Q93-331; Q939.92

A