張　丹，王　玲，劉　曉，闞云超，李丹丹

(南陽師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室，河南南陽 473061)

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玉米AGO基因在籽粒發(fā)育過程中的表達分析

張丹，王玲，劉曉，闞云超，李丹丹*

(南陽師范學(xué)院 河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點實驗室，河南南陽 473061)

以玉米自交系‘昌7-2’授粉后4個時間點(授粉后7、10、14和20 d)的籽?？俁NA為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，對玉米中5個Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)在籽粒不同發(fā)育時期的表達譜進行了研究。結(jié)果表明：AGO1和AGO2在籽粒發(fā)育過程中呈現(xiàn)一致的表達趨勢，在授粉后7 d的籽粒中表達量最高，從授粉后7 d到20 d呈持續(xù)下降的趨勢。AGO4、AGO10和AGO18具有一致的表達趨勢，均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在授粉后10 d的籽粒中表達量最低。結(jié)合實驗室前期獲得的miRNA在玉米籽粒不同發(fā)育階段的表達譜，發(fā)現(xiàn)不同AGO家族基因可協(xié)助其靶標(biāo)miRNA參與玉米籽粒發(fā)育調(diào)控。

玉米；籽粒；AGO基因；表達譜

miRNA可參與生物的生長、分化、增殖和脅迫反應(yīng)等一系列生物學(xué)過程[1]。miRNA和Argonaute(AGO)蛋白家族形成RNA-induced silencing complex(RISC)，從而調(diào)節(jié)序列特異性靶基因沉默或翻譯抑制[2-3]。AGO蛋白是RISC的功能核心，具有高度保守性。AGO蛋白由N末端、PAZ、MID和PIWI 4個結(jié)構(gòu)域組成。PAZ區(qū)能非序列特異性識別結(jié)合雙鏈小RNA 3′端2個核苷酸，MID與PIWI界面處的“保守口袋”識別結(jié)合小RNA 5′端第一位核苷酸，PIWI區(qū)具有切割mRNA的催化中心[4]。植物中AGO蛋白和miRNA共同參與維持基因組的穩(wěn)定、調(diào)控組織發(fā)育、響應(yīng)逆境適應(yīng)性應(yīng)答、在RNA層面對入侵核酸(轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒和植物病毒)的免疫、對靶mRNA進行切割或翻譯水平的抑制，以及在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上控制轉(zhuǎn)座元件的移動等[5-7]。目前，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AGO蛋白10個[8]，大豆中發(fā)現(xiàn)22個[9]，水稻中19個[10]，玉米中18個[11-12]。所有的開花植物的AGO蛋白家族可以歸為3個大類：AGO1/5/10家族、AGO2/3/7家族和AGO4/6/8/9家族，AGO18是與AGO1/5/10 大類親緣關(guān)系較近的一個分支[8,13]。

在擬南芥中，AGO1主要參與植物的生長發(fā)育調(diào)控和脅迫反應(yīng)[14]，AGO2參與植物的抗菌和病毒防御活動[15]，AGO4調(diào)控RNA介導(dǎo)DNA甲基化信號通路以及與內(nèi)源的siRNAs結(jié)合導(dǎo)致基因沉默[16]，AGO5調(diào)控雌配子體發(fā)生和RNA沉默[17]，AGO6參與調(diào)控tasiRNA的甲基化、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性和分生組織的根除[18]，AGO7主要參與植物葉的發(fā)育以及維持分生組織以及植物從幼嫩到成熟生長階段的過渡[19]，AGO9和韌皮部生殖細胞的分化抑制和DNA修復(fù)有關(guān)[6]，AGO10調(diào)控植物的頂端分生組織[20]。玉米18個AGO家族蛋白可歸屬在5個大類中，AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7、AGO4和AGO18[11]。AGO9歸在AGO4家族中，參與生殖細胞中體壁細胞的分化[21]，AGO18參與生殖細胞的發(fā)展[12]。

玉米是世界上重要的糧食作物和飼料作物，目前在miRbase數(shù)據(jù)庫中收錄的玉米成熟miRNA序列有321條，它們參與到玉米的新陳代謝的各個過程中[22-28]。對miRNA功能的解析離不開對AGO基因功能的探索。但是目前關(guān)于玉米AGO基因的表達譜及功能研究并不多。因此，我們在前期對玉米籽粒發(fā)育過程的miRNA深入研究的基礎(chǔ)上[29]，選取河南省普遍種植的玉米自交系‘昌7-2’為研究對象，選取5個AGO蛋白大類中的代表性AGO基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)，研究其在玉米授粉后不同天數(shù)(7、10、14和20 d)的表達譜，為探索AGO基因和miRNA協(xié)同調(diào)控玉米籽粒的形成機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供的玉米自交系‘昌7-2’為試驗材料，分別取授粉后7、10、14和20 d的籽粒，置于液氮中研磨，TRIzol(ThermoFisher Scientific)法提取總RNA。

表1　Real-time PCR所用引物Table 1　Primer sets for real-time PCR

1.2方法

1.2.1AGO基因的克隆與測序取玉米籽?？俁NA 2 μg，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進行cDNA的合成。利用表1所列引物及高保真酶擴增6個AGO基因。PCR產(chǎn)物采用DNA凝膠回收試劑盒(Axygen)回收，將回收的目的片段連接PMD-19 T easy載體(Takara)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果用DNAMAN進行序列比對。

1.2.2實時熒光定量PCR (Real-time PCR)取玉米授粉后不同時期籽粒的總RNA 2 μg，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)進行cDNA的合成。采用FastStart Universal SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Roche)進行Real-time PCR。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 變性15 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40個循環(huán)。PCR引物如表1所示，tubulin為內(nèi)參基因，滅菌雙蒸水模板為陰性對照。PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

2　結(jié)果與分析

選擇玉米自交系‘昌7-2’授粉后7、10、14和20 d的籽粒為研究對象，利用TRIzol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠檢測RNA質(zhì)量(圖1)。結(jié)果顯示，所提RNA無基因組污染，28S和18S條帶清晰，OD260/OD280在1.8～2.0之間，表明RNA完整，蛋白污染較少，可用于后續(xù)實驗。

利用玉米B73基因組數(shù)據(jù)庫中得到的5個AGO基因序列設(shè)計引物，通過高保真酶在玉米自交系‘昌7-2’中擴增相應(yīng)的AGO基因，得到AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18均有單一的擴增產(chǎn)物，且無引物二聚體污染(圖2)，通過測序鑒定發(fā)現(xiàn)，‘昌7-2’中擴增到的AGO2和AGO10基因片段與B73中對應(yīng)的基因序列完全相同，AGO4和AGO18與B73僅差別1個堿基，AGO1擴到的為AGO1a-like基因AC199001.3_FG005，與AGO1一致性為88.8%，與B73中對應(yīng)的基因差別僅1個堿基(圖3)。表明在‘昌7-2’中擴增的為真實的AGO家族目的基因。

為了獲得AGO基因在玉米授粉后籽粒中的表達譜，選取授粉后7、10、14和20 d的籽?？俁NA為研究對象，采用實時熒光定量PCR方法檢測不同AGO基因在籽粒發(fā)育過程中的表達水平。結(jié)果如圖4所示，AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18在玉米籽粒形成過程中均有表達。AGO1和AGO2在籽粒發(fā)育過程中呈現(xiàn)一致的表達趨勢，在授粉后7 d的籽粒中表達量最高，從授粉后7 d到20 d呈持續(xù)下降的趨勢。AGO4、AGO10和AGO18存在一致的表達趨勢，均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在授粉后10 d的籽粒中表達量最低。AGO4和AGO18在授粉后7 d的籽粒中表達量最高，到10 d降至最低，隨后逐漸上升。而AGO10在授粉后7 d的籽粒中表達量與14 d基本持平，10 d時最低，在籽粒發(fā)育后期，至20 d時表達量最高。表明不同的AGO基因可能在玉米籽粒發(fā)育的不同階段發(fā)揮作用。

M.DL2000；1～4分別為授粉后7、10、14和20 d的玉米籽粒RNA圖1　不同發(fā)育時間點玉米籽粒RNA電泳結(jié)果M. DL2000；1-4 represented RNAs of 7,10,14 and 20 dFig. 1　RNAs being extracted from different developmental stages of maize seed after pollination

M.DL2000；1～6分別為AGO1、AGO2、AGO4、AGO10、AGO18和tubulin圖2　5個AGO基因RT-PCR擴增結(jié)果M. DL2000；1-6 represented the amplification results of AGO1,AGO2,AGO4,AGO10,AGO18 and tubulinFig. 2　RT-PCR results of amplification of five AGO genes

圖3　昌7-2和B73中AGO1(A)、AGO4(B)、AGO18(C)基因比對結(jié)果Fig. 3　Alignment results of AGO1(A),AGO4(B),AGO18(C)between Chang 7-2 and B73

圖4　AGO家族基因在玉米授粉后不同天數(shù)籽粒中的相對表達量Fig. 4　The relative expression of AGO genes in different developmental stages of maize seed after pollination

3　討　論

在RISC中，miRNA作為向?qū)б龑?dǎo)AGO蛋白在特定的部位發(fā)揮相應(yīng)的功能，AGO蛋白是RISC的核心元件[30]。本研究以河南省推廣種植的玉米自交系‘昌7-2’為研究對象，首次探索了玉米授粉后(7、10、14和20 d)不同時間點AGO基因的表達譜。結(jié)果顯示：AGO1和AGO2在授粉后7 d的籽粒中表達量最高，隨后呈持續(xù)下降的趨勢。而AGO4、AGO10和AGO18則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在授粉后10 d的籽粒中表達量最低。表明這些不同的AGO基因可能在玉米籽粒形成的不同階段發(fā)揮各自特殊的功能。

在籽粒發(fā)育早期主要進行細胞分裂、胚胎發(fā)生和組織器官形成等活動，該階段高表達的miRNA主要為miR159、miR165/166等家族[29,31]，而AGO1可通過扣押miR165/166，促進miRNA miR165/166靶基因Class Ⅲ homeodomain-leucine zipper(HD-ZIP Ⅲ)轉(zhuǎn)錄因子的表達，HD-ZIP Ⅲ家族基因在莖頂端分生組織建立、維管發(fā)育和側(cè)生器官的極性形成過程中發(fā)揮重要作用，突變HD-ZIP Ⅲ家族基因?qū)⒃斐蓡吾樞巫尤~的形成[32-33]。玉米AGO1在授粉后7 d的籽粒中高表達，隨后持續(xù)下降，這與其負向調(diào)控的miR165/166家族的表達趨勢是相符的，表明在籽粒發(fā)育早期的胚胎形成過程中，AGO1可通過miR165/166等小分子RNA發(fā)揮調(diào)控作用。與AGO1同家族的AGO10，可作為miR166/165的誘餌，阻止miR166/165進入AGO1復(fù)合體，從而抑制HD-ZIP Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子的表達[34]。擬南芥中研究也表明，AtZLL/AtAGO10在頂端分生組織的維持過程中發(fā)揮作用[35-36]。AGO10基因在玉米籽粒發(fā)育早期組織器官形成過程的低表達和營養(yǎng)物質(zhì)積累時期的高表達，可能與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。

玉米授粉后10～15 d為籽粒從細胞分裂和組織器官形成到營養(yǎng)物質(zhì)積累的過渡階段，AGO4和AGO18均在授粉后10 d的籽粒中表達量最低，隨后在籽粒營養(yǎng)物質(zhì)積累過程中持續(xù)升高。擬南芥中AtAGO4主要作用于siRNA，發(fā)揮表觀遺傳沉默作用[37-38]。而AGO18只存在于草本植物中，在植物繁殖生長和病毒防御過程中發(fā)揮作用[12]，玉米AGO18有兩個轉(zhuǎn)錄本，其中的一個ZmAGO18b在雄性減數(shù)分裂期間絨氈層和生殖細胞富集，這與24-nt phasiRNA表達趨勢一致，因此預(yù)測玉米ZmAGO18b可能結(jié)合24-nt phasiRNAs發(fā)揮作用[39]，AGO4和AGO18在籽粒發(fā)育過渡期的低表達及營養(yǎng)物質(zhì)累積期的高表達可能與其功能的實現(xiàn)密切相關(guān)。本結(jié)果為深入探索不同的AGO基因?qū)τ衩鬃蚜０l(fā)育的作用機制奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis ofAGOGenes during Maize Seed Development

ZHANG Dan，WANG Ling，LIU Xiao，KAN Yunchao，LI Dandan*

(Henan Key Laboratory of Insect Biology in Funiu Mountain，Nanyang Normal University, Nanyang Henan 473061，China)

The expression profiles of 5AGOgenes(AGO1，AGO2，AGO4，AGO10 andAGO18)in different developmental stages of maize seed(ZeamaysL.inbred line，‘Chang 7-2’)after pollination were analyzed by the method of real-time quantitative PCR.Results showed that, the expression pattern ofAGO1 andAGO2 were similar during maize seed development, showing a decline trend from the 7thday after pollination (DAP) to the 20thDAP, with much more accumulation at the 7thDAP.The expression pattern ofAGO4,AGO10 andAGO18 were similar, with a trend of being decreased first then increased, with the lowest expression at the 10thDAP.With our previous results of expression pattern of miRNAs during maize seed development, we found that differentAGOgene families together with their target miRNAs, can involved in the regulation of maize seed development.

ZeamaysL.；seed；AGOgene；expression pattern

1000-4025(2016)09-1752-05doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1752

2016-05-03;修改稿收到日期:2016-07-06

河南省科技廳農(nóng)業(yè)重點攻關(guān)項目(112102110158)

張 丹(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事植物與昆蟲互作研究。E-mail：15514180175@163.com

李丹丹，博士，副教授，主要從事植物與昆蟲互作研究。E-mail：lidannytc@126.com

Q789; Q946

A