時王珂，孫奕玥，舒志明，張躍進，梁宗鎖，郭宏波

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物國家地方聯(lián)合工程研究中心，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

?

丹參多酚氧化酶基因的克隆及表達(dá)分析

時王珂，孫奕玥，舒志明，張躍進，梁宗鎖，郭宏波*

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物國家地方聯(lián)合工程研究中心，西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

前期研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶(PPO)能正向調(diào)控丹酚酸B合成，該研究運用RACE技術(shù)，從丹參毛狀根中克隆到多酚氧化酶基因(SmPPO，GenBank登錄號為KF712274)全長序列，其cDNA全長1 930 bp，開放閱讀框為1 770 bp，編碼589個氨基酸。將SmPPO與管狀花目其它4個物種進行氨基酸序列比對，在N端類囊體轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)都存在2個N-豆蔻?；稽c。在丹參毛狀根培養(yǎng)液中加入不同誘導(dǎo)因子，利用實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在酵母提取物處理中表達(dá)量顯著上調(diào)，但在銀離子、抗壞血酸和L-半胱氨酸處理中表達(dá)受到明顯抑制。運用HPLC技術(shù)同步檢測毛狀根中丹酚酸B含量，顯示出與基因表達(dá)相同的變化趨勢。研究表明，丹參中多酚氧化酶基因(SmPPO)對丹酚酸B的合成具有正向調(diào)控作用。

丹參；多酚氧化酶；基因克??；序列全長；基因表達(dá)

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是由核基因編碼的含銅金屬酶，廣泛存在于植物、真菌和昆蟲中。它們能氧化多酚類化合物生成不穩(wěn)定的醌類物質(zhì)，醌發(fā)生聚合并與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成黑色素或褐色素，導(dǎo)致果蔬褐變、營養(yǎng)品質(zhì)和商品性下降。醌類物質(zhì)具有毒性，并通過共價調(diào)節(jié)與氨基酸發(fā)生反應(yīng)形成抗?fàn)I養(yǎng)機制，是植物抵御病蟲害的重要手段。而酚類化合物在抗氧化、缺血再灌注和抗血栓形成等方面具有顯著藥理學(xué)作用[1-2]。但有關(guān)PPO調(diào)控植物次生代謝物，特別是酚酸類物質(zhì)合成的機理還未見報道。

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)根莖是中國用量最大的中藥材之一，在治療心腦血管疾病和抗氧化等方面具有顯著療效。酚酸類物質(zhì)是丹參水溶性有效成分的主要組分，丹酚酸B在丹參酚酸類物質(zhì)中含量最高(80%左右)。丹參植物因具有基因組小、染色體數(shù)目少、組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟等優(yōu)點，被認(rèn)為是中藥研究的理想模式植物[3]。因此研究其合成調(diào)控機理對深入理解酚酸類物質(zhì)合成的次生代謝途徑及藥材質(zhì)量控制具有重要意義。

盡管迄今未見PPO或其基因調(diào)控酚酸類物質(zhì)合成的報道，但已有證據(jù)表明它們在一些相關(guān)過程中發(fā)揮了重要作用，如在活性氧調(diào)節(jié)[4]、抗逆信號分子響應(yīng)[5-7]和苯丙烷次生代謝[8]方面。課題組前期已發(fā)現(xiàn)，作為活性氧的主要種類，H2O2能增強苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)活性，促進丹酚酸B積累[9-10]。在干旱脅迫下PPO基因的過表達(dá)會使番茄中多酚含量增加，同時產(chǎn)生高強度活性氧脅迫[11-12]，抗性番茄品系的總酚含量和PPO活性均比敏感品系高，在病蟲害侵襲后，抗性番茄的PPO活性升高速率比敏感品系快[13]。這些結(jié)果表明，PPO基因在酚酸類物質(zhì)的合成中發(fā)揮了重要作用。

前期課題組從蓮藕(NelumbonuciferaGaertn.)地下莖莖尖中克隆出PPO基因全長序列[14]。本研究以丹參毛狀根為試材，利用該基因在銅(Cu)結(jié)合區(qū)的保守性，運用RACE方法對其cDNA全長進行克??；在丹參毛狀根培養(yǎng)液中分別添加前期預(yù)試驗確定的PPO活性增強劑(酵母提取物)和抑制劑(半胱氨酸、抗壞血酸和銀離子)，運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因的表達(dá)，為進一步揭示丹酚酸B等酚酸類物質(zhì)合成的次生代謝途徑奠定堅實基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1丹參毛狀根培養(yǎng)與誘導(dǎo)處理

1.1.1毛狀根的獲得以發(fā)狀農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes，ATCC15834)侵染丹參葉片外植體，取0.3 g在250 mL搖瓶中加入50 mL不含激素的液體MS培養(yǎng)基。置于搖床中以110～120 r/min速度在25 ℃下培養(yǎng)3周[15]。培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)因子后再培養(yǎng)7 d，采集毛狀根在液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于PPO基因克隆和丹酚酸B含量檢測。

1.1.2誘導(dǎo)處理實驗室前期對3個已報道可抑制PPO活性的L-半胱氨酸、抗壞血酸和檸檬酸，以及可促進丹酚酸B積累的酵母提取物和促進丹參酮積累的Ag+等5個誘導(dǎo)因子，對丹參毛狀根PPO活性的影響進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了檸檬酸抑制效果不顯著，其余4個誘導(dǎo)因子作用均達(dá)到顯著水平，因此在本研究中用于評估PPO基因表達(dá)。

精密稱取50 g酵母提取物，溶于250 mL無菌水中，再加入1 L甲醇。把混合液置于4 ℃進行4 d沉淀后，將沉淀再次溶于250 mL無菌水中。在溶液中加入375 mL甲醇，4 ℃下再次沉淀。將沉淀再溶于200 mL無菌水中，在121 ℃滅菌30 min后保存于4 ℃?zhèn)溆谩＝湍柑崛∥餄舛纫蕴呛縼砗饬?，以蔗糖濃度作對照，采用蒽酮比色法進行測定[16]。

將Ag+、L-半胱氨酸和抗壞血酸分別加入毛狀根培養(yǎng)液中，最終體積摩爾濃度分別為30 μmol/L、0.5 mmol/L和0.5 mmol/L。其原液均用蒸餾水配制并通過0.22 μm濾膜過濾滅菌。每個處理重復(fù)3次，結(jié)果由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2PPO基因全長序列的克隆

1.2.1RNA提取與PCR擴增將以液氮速凍的毛狀根研磨成粉末后，按照試劑盒RNAiso Plus(TaKaRa，日本)操作步驟提取RNA。RNA質(zhì)量在核酸/蛋白測定儀上檢測純度，以1%凝膠電泳檢測完整度。吸取2 μg RNA，采用RevertAid試劑盒(Thermo Scientific，美國)合成cDNA第一鏈。

采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件，在已發(fā)表PPO基因的保守區(qū)設(shè)計并合成引物(表1)。25 μL總反應(yīng)體系中含1 μL cDNA，12.5 μL 2×Taq Master Mix(TaKaRa，日本)，正向和反向引物各2 μL(表1中PPO1和PPO2)。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，再94 ℃變性60 s，48 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物采用膠回收試劑盒(BioTeKe，北京)進行回收?；厥债a(chǎn)物與pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有Amp的LB培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白色單克隆、陽性菌液送公司測序。

3′-RACE(快速擴增cDNA末端法)以PPO3和UPM為引物，根據(jù)Advantage 2 PCR試劑盒(Thermo Scientific，美國)指示進行操作。50 μL PCR反應(yīng)體系中包含cDNA模板2.5 μL，50×Advantage 2混合酶液1 μL，UPM引物5 μL，PPO3引物1 μL，其余為無菌水。PCR反應(yīng)程序為94 ℃變性30 s，72 ℃退火90 s，5個循環(huán)，再在94 ℃變性30 s,70 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s條件下5個循環(huán)；最后，94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，28個循環(huán)。5′-RACE以PPO4和UPM為引物，采用上述3′RACE方法進行擴增。擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。對目的片段進行膠回收，回收方法及測序等方法同上。

1.2.2SmPPO基因序列分析及氨基酸序列比對采用NCBI中Blast程序?qū)Φ⒚珷罡鵖mPPO基因序列及推導(dǎo)氨基酸序列進行分析(http://balst.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。對核酸和氨基酸序列的開放閱讀框采用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預(yù)測。氨基酸功能結(jié)構(gòu)域的分析在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)上進行。

將包含丹參所在唇形科的管狀花目中所有PPO基因的推導(dǎo)氨基酸序列進行比對。4個物種PPO基因分別來自芝麻SesamumindicumL.(GenBank登錄號JQ658360)、甘薯Ipomoeabatatas(L.) Lam.(登錄號AY822711)、馬鈴薯SolanumtuberosumL.(登錄號U22921)、茄子葉綠體SolanummelongenaL. chloroplast(登錄號GQ246219)和茄子SolanummelongenaL.(登錄號GQ149349)。

表1　丹參中多酚氧化酶基因克隆及實時定量 PCR所用引物Table 1　Primers used in gene cloning of polyphenol oxidase and real-time PCR

1.2.3實時熒光定量PCR將丹參毛狀根cDNA第一條鏈模板稀釋10倍，作為實時熒光定量PCR模板。PCR反應(yīng)采用ABI 7300實時定量PCR儀。在八連管中依次加入20 μL體系，即cDNA模板5 μL，上下游引物各1 μL，避光加入2×Q-PCR Mix containing SYBR Green II 10 μL，RNase-Free Water 3 μL。用PCR儀器所用的軟件來校準(zhǔn)熒光數(shù)據(jù)和檢測Ct值。擴增丹參PPO基因所用的引物見表1。每個樣品做3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)做2個技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共45個循環(huán)。從65 ℃到95 ℃進行融解曲線測定。當(dāng)所有循環(huán)完成時，qPCR樣品溶解曲線被統(tǒng)計和檢測，以確定每個PCR產(chǎn)物已被擴增。用2-ΔΔCt法計算SmPPO基因表達(dá)量[17]。

1.2.4丹酚酸B含量檢測丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)樣品準(zhǔn)備及其檢測方法主要參照Yang等[18]，并作少許修改。將干燥毛狀根研磨成粉末后，取40 mg，加入8 mL甲醇與水的混合樣(70∶30，v/v)，超聲45 min后過0.45 mm濾膜。在12 000 r/min條件下將濾液離心10 min。取上清，過0.45 μm濾膜，保留濾液待用。

SAB含量檢測采用高效液相色譜法(HPLC)，在Waters 1525液相色譜檢測系統(tǒng)(Milford，美國)上進行。運用Waters 2996光電二極管檢測器進行檢測，在SunFire C18柱(250×4.6 mm，5 μm)上梯度洗脫，柱溫30 ℃。流動A相為乙腈，B相為0.01%磷酸溶液(pH 2.6)，流速1.0 mL/min，進行梯度洗脫：5%～20% A(V/V)線性梯度0～10 min；20%～25% A(V/V)線性梯度10～15 min；25% A(V/V)線性梯度15～20 min；25%～20% A(V/V)線性梯度20～25 min；20%～30% A(V/V)線性梯度25～28 min；30% A(V/V)線性梯度28～40 min；30%～100% A(V/V)線性梯度40～45 min。檢測波長設(shè)定為288 nm，由丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品(批號115939-25-8，中國藥品生物制品檢定所)確定其質(zhì)量。定量分析每個處理重復(fù)6次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

2　結(jié)果與分析

2.1丹參多酚氧化酶基因(SmPPO)和推導(dǎo)氨基酸序列特征

2.1.1SmPPO基因序列以丹參毛狀根為試材，運用PPO1和PPO2引物擴增出一條500 bp條帶(圖1,A)。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該片段與其它物種PPO基因序列高度同源，表明它是PPO基因片段。根據(jù)該基因片段序列，再設(shè)計特異引物PPO3，并與UPM引物一起進行3′-RACE擴增，擴增出一條1 200 bp片段(圖1，B)。運用另一特異引物PPO4與UPM引物組合在5′-RACE中擴增出一條700 bp片段。經(jīng)拼接，SmPPO基因cDNA全長1 930 bp，含開放閱讀框1 770 bp(從19 bp至1 788 bp)，編碼589個氨基酸。在閱讀框5′和3′端分別發(fā)現(xiàn)18 bp和142 bp非翻譯區(qū)。

1. 獲得cDNA的1/10質(zhì)量濃度為模板；2. cDNA原液為模板；3. 沒有加模板的空白對照；4. 5′-RACE； 5. 3′-RACE；M. Marker圖1　丹參毛狀根中克隆的PPO基因片段1. 1/10 concentration of harvest cDNA as template; 2. Harvest cDNA as template; 3. Blank control without template; 4.5′-RACE fragment; 5.3′-RACE fragment; M. DNA markerFig.1　The SmPPO gene cloned from Salvia miltiorrhiza hairy root

2.1.2SmPPO氨基酸序列SmPPO蛋白屬于酪氨酸超家族，有PPO1_DWL和PPO1_FKDV等2個結(jié)構(gòu)域(圖2)。并含有2個銅離子結(jié)合區(qū)(CuA和CuB)，均富含組氨酸殘基。CuA結(jié)合區(qū)為176(組氨酸)～206(組氨酸)；CuB結(jié)合區(qū)為328(組氨酸)～362(組氨酸)(圖4)。

2.2PPO蛋白序列比較

典型的植物PPO包含3個結(jié)構(gòu)域：N-末端葉綠體轉(zhuǎn)運肽(cTP)、CuA和CuB(酪氨酸酶)結(jié)構(gòu)域以及C-末端伸展區(qū)(圖3)。管狀花目植物的6條PPO蛋白中，前35個氨基酸均含有大量絲氨酸殘基，這正是cTP中基質(zhì)肽段的典型特征。距該序列不遠(yuǎn)處就是類囊體轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域DRRxxxxxxGGLY(M)G(圖4黑框部分)和丙氨酸模體(AxA)。有趣的是，在管狀花目全部6個PPO蛋白的N端類囊體轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域中都發(fā)現(xiàn)有2個N-豆蔻酰化位點(圖4黑框中的2條藍(lán)線)。Cu結(jié)合位點特征是有較多保守組氨酸殘基。在CuA結(jié)構(gòu)域中，第一條序列起始于HCAYCN(D)GA(G)Y模體，并終止于LQV(I)HNSWLFFPFH模體。而在CuB結(jié)構(gòu)域中，第一條序列起始于HxxV(I)HxxxGD(T)模體，終止于N(H)FYSAG(A)R(L)DP(I)L(V)FY(F)C(A)HH模體。PPO1_DWL結(jié)構(gòu)域和PPO1_KFDV結(jié)構(gòu)域組成了PPO的C-末端。在PPO1_DWL結(jié)構(gòu)域中，酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點與DWL模體緊密結(jié)合(圖4)。

圖2　SmPPO編碼的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)與分析Fig.2　Conserved domain analysis of SmPPO encoding sequence

圖3　管狀花目植物的多酚氧化酶氨基酸的功能型結(jié)構(gòu)域及保守模體示意圖Fig.3　Schematic diagram of functional domains and conserved motifs in Tubiflorae plant PPO amino acid sequences

2.3丹參SmPPO基因表達(dá)與丹酚酸B含量檢測

在丹參毛狀根培養(yǎng)液中分別加入酵母提取物(YE)、Ag+、抗壞血酸(Vc)和L-半胱氨酸4種誘導(dǎo)因子進行處理，運用實時熒光定量PCR技術(shù)分別檢測不同處理下SmPPO基因的表達(dá)，同步運用HPLC技術(shù)檢測丹酚酸B含量。結(jié)果顯示，PPO基因表達(dá)在酵母提取物中顯著增強，但在其余3種誘導(dǎo)子處理中被顯著抑制(圖5，A)。丹酚酸B含量的變化與SmPPO基因表達(dá)趨勢一致(圖5，B)，說明SmPPO基因?qū)Φし铀酈的合成具有正向調(diào)控作用。

圖4　SmPPO基因推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.4　SmPPO gene sequence and its putative amino acid sequence

CT.對照；YE.酵母提取物；Vc.抗壞血酸；L-cys.L-半胱氨酸；不同小寫字母代表處理間顯著性差異(P<0.05)圖5　不同誘導(dǎo)處理下丹參毛狀根SmPPO基因表達(dá)(A)及丹酚酸B含量(B)CT. Contral; YE. Yeast extralt; Vc. Ascorbic acid; L-cys. L-cysteine; Columns with different letters represent significant difference under different trentments (P<0.05)Fig.5　SmPPO gene expression (A) and its effect on the accumulation of salvianolic acid B (B) in S. miltiorrhiza hairy root under different elicitor treatments

3　討　論

本研究首次報道了PPO基因調(diào)控丹酚酸B等酚酸類次生代謝物合成。除采用直接調(diào)控PPO活性的誘導(dǎo)因子外，不少信號分子如乙烯、茉莉酸、水楊酸和其它脅迫如干旱等也可誘導(dǎo)植株特定組織或某一發(fā)育階段PPO基因表達(dá)[6]。在干旱脅迫下，PPO基因過表達(dá)使番茄中活性氧大量生成，總酚含量增加[4-5]。因此，推測以H2O2為代表的活性氧在PPO基因調(diào)控酚酸類物質(zhì)的合成中扮演了重要角色。課題組前期已發(fā)現(xiàn)，由水楊酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2增強了苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)的活性，促進了丹酚酸B的積累[9-10]。

課題組還發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞層面上，外施水楊酸可使鈣離子向丹參細(xì)胞內(nèi)流動[10]，刺激NAD(P)H氧化酶活性，促進胞外H2O2釋放，造成高強度氧脅迫[19-20]，PAL基因表達(dá)和酶活性升高，造成迷迭香酸和丹酚酸B大量積累[10,21]。與被誘發(fā)的內(nèi)源H2O2一樣，外源H2O2也可增強PAL和TAT的活性，促進丹酚酸B的積累[9]。

在鈣離子向胞內(nèi)流動的同時，因K+/H+交換，內(nèi)流的H+會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化，外流K+使胞外介質(zhì)堿化[22]。通過糖基化等蛋白修飾，細(xì)胞質(zhì)酸化會提高PPO活性[23-24]。胞外介質(zhì)堿化使PAL活性升高，并持續(xù)合成迷迭香酸[21]、丹酚酸B[9]、異黃酮苷類[25]、木質(zhì)素[26]和植物抗毒素[22]等。

雖然Ag+已被證實可以提高紅豆杉懸浮細(xì)胞中的紫杉醇含量[27]，曼陀羅毛狀根中的生物堿含量[28]，以及丹參毛狀根中的丹參酮含量[29]，但其調(diào)控酚類物質(zhì)積累的作用不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)Ag+顯著抑制了PPO活性和丹酚酸B積累。Beyer 等[30]發(fā)現(xiàn)Ag+可抑制植物中乙烯活性，因為其受體結(jié)合區(qū)Cu2+可被Ag+替換，Ag+還可通過受體傳輸信號來阻止受體發(fā)生變化[31]。另一方面，Ag+與組氨酸殘基中的咪唑基團[32]及色氨酸[33]、亮氨酸[34]均有絡(luò)合作用。這可能是與銀離子有較大體積以及更親和特性有關(guān)，所以比銅離子具備更強的結(jié)合能力[34]。

L-半胱氨酸對PPO的抑制機理仍存在爭議[41]。一種觀點認(rèn)為，抑制的發(fā)生是因為奎寧和半胱氨酸形成共軛結(jié)構(gòu)[42]；另一種觀點認(rèn)為，半胱氨酸通過與銅離子在活性位點發(fā)生不可逆結(jié)合，從而直接抑制PPO的活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，PPO基因表達(dá)被半胱氨酸顯著抑制，證實了第二種觀點，因為半胱氨酸的SH基團與銅離子有很強的結(jié)合力，從而在PPO蛋白的銅離子結(jié)合區(qū)取代組氨酸配體，和/或從酶中將銅離子完全移除[41]。

研究已發(fā)現(xiàn)，酵母提取物可促進丹參毛狀根中丹參酮的積累[29]，但它對酚類物質(zhì)積累的調(diào)控還不清楚。對成分和結(jié)構(gòu)的分析顯示，酵母提取物是一種能促進大豆子葉與胚軸中大豆抗毒素積累的葡聚糖[43]。多糖結(jié)構(gòu)和對多糖連接位點的識別對決定糖蛋白的結(jié)構(gòu)和作用非常重要。另一方面，一些苯丙酯類被證實能與糖、細(xì)胞壁的碳水化合物或有機酸發(fā)生共軛作用，這對誘導(dǎo)苯丙胺新陳代謝非常重要[44]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)酵母提取物顯著增強PPO活性，本研究進一步發(fā)現(xiàn)了其促進PPO基因表達(dá)和丹酚酸B積累的作用。

[1]ROBARDS K, PRENZLER P D, TUCHER G,etal. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits [J].FoodChemistry, 1999, 66(4): 401-436.

[2]ZHAO G R, ZHANG H M, YE T X,etal. Characterization of the radical scavenging and antioxidant activities of danshensu and salvianolic acid B [J].FoodChemistryandToxicology, 2008, 46(1): 73-81.

[3]宋經(jīng)元, 羅紅梅, 李春芳, 等. 丹參藥用模式植物研究探討[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2013, 48(7): 1 099-1 106.

SONG J Y, LUO H M, LI C F,etal.Salviamiltiorrhizaas medicinal model plant [J].ActaPharmaceuticaSinica, 2013, 48(7): 1 099-1 106.

[4]TREBST A, DEPKA B. Polyphenol oxidase and photosynthesis research [J].PhotosyntheticResearch, 1995, 46(1/2): 41-44.

[5]CONSTABEL C P, BERGEY D R, RYAN C A. Systemin activates synthesis of wound-inducible tomato leaf polyphenol oxidase via the octadecanoid defense signaling pathway [J].ProceedingsofNationalAcademyofScienceofUnitedStatesofAmerica, 1995, 92(2): 407-411.

[6]THIPYAPONG P, STEFFENS J C. Tomato polyphenol oxidase: differential response of the polyphenol oxidase F promoter to injuries and wound signals [J].PlantPhysiology, 1997, 115(2): 409-418.

[7]MAHANIL S, ATTAJARUSIT J, STOUT M J,etal. Overexpression of tomato polyphenol oxidase increase resistance to common cutworm[J].PlantScience, 2008, 174(4): 456-466.

[8]KOJIMA M, TAKEUCHI W. Detection and characterization of p-coumaric acid hydroxylase in mung bean,Vignamungo, seedlings [J].JournalofBiochemistry, 1989, 105(2): 265-270.

[9]陳紅艷, 劉連成, 董娟娥, 等. H2O2參與水楊酸誘導(dǎo)丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 生物工程學(xué)報, 2012, 28(7): 834-846.

CHEN H Y, LIU L C, DONG J E,etal. Hydrogen peroxide is involved in the signal transduction of salicylic acid-induced salvianolic acid B biosynthesis inSalviamiltiorrhizacell cultures [J].ChineseJournalofBiotechnology, 2012, 28(7): 834-846.

[10]GUO H, DANG X, DONG J. Peroxide hydrogen and nitric oxide are involved in salicylic acid-induced salvianolic acid B production inSalviamiltiorrhizacell cultures [J].Molecules, 2014, 19(5): 5 913-5 924.

[11]THIPYAPONG P, HUNT M D, STEFFENS J C. Antisense down regulation of polyphenol oxidase results in enhanced disease susceptibility [J].Planta, 2004, 220(1): 105-117.

[12]THIPYAPONG P, MELKONIAN J, WOLFE D W,etal. Suppression of polyphenol oxidase increases stress tolerance in tomato [J].PlantScience, 2004, 167(4): 693-703.

[13]THYGESEN P W, DRY I B, ROBINSION S P. Polyphenol oxidase in potato [J].PlantPhysiology, 1998, 109(2): 525-531.

[14]張躍進, 郝曉燕, 梁宗鎖, 等. 蓮藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆與表達(dá)分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 19(4): 634-641.

ZHANG Y J, HAO X Y, LIANG Z S,etal. Cloning of polyphenol oxidase gene(PPO) from lotus rhizome bud and its expression in different tissues [J].JournalofAgriculturalBiotechnology, 2011, 19(4): 634-641.

[15]HU Z B, ALFERMANN A W. Diterpenoid production in hairy root cultures ofSalviamiltiorrhiza[J].Phytochemistry, 1993, 32(3): 699-703.

[16]DUBOIS M, GILLES D A, HAMILTON J K,etal. Colorimetric method for the determination of sugars and related substance[J].AnalyticalChemistry, 1956,28(3): 350-356.

[17]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[18]YANG D F, LIANG Z S, LIU J L. LC fingerprinting for assessment of the quality of the lipophilic components ofSalviamiltiorrhiza[J].Chromatographia, 2009,69(5/6): 555-560.

[19]HALLIWELL B, GUTTERIDGE J. Free Radicals in Biology and Medicine (3rd Edn)[M]. Oxford University Press, Oxford, 1999：936.

[20]PEI Z, MURATA Y, BENNING G,etal. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells [J].Nature, 2000, 406(6 797): 731-734.

[21]GUO H, ZHU NAN, DEYHOLOS M K,etal. Calcium mobilization in salicylic acid-inducedSalviamiltiorrhizacell cultures and its effect on the accumulation of rosmarinic acid [J].AppliedBiochemistryandBiotechnology, 2015, 175(5): 2 689-2 702.

[22]ARMERO J, TENA M. Possible role of plasma membrane H+-ATPase in the elicitation of phytolexion and related isoflavone root secretion in chickpea (CicerarietinumL.) seedlings [J].PlantSciences, 2001, 161(4): 791-798.

[23]SOMMER A, NE’EMAN E, STEFFENS J C,etal. Import, targeting, and processing of a plant polyphenol oxidase [J].PlantPhysiology, 1994, 105(4): 1 301-1 311.

[24]STEFFENS J C, HAREL E, HUNT M D. Polyphenol oxidase[M]//Ellis B Eetal. Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism. Plenum Press, New York, 1994: 275-312.

[25]HATTORI T, OHTA Y. Induction of phenylalanine ammonia-lyase activation and isoflavone glucoside accumulation in suspension-cultured cells of red bean,Vignaangularis, by phytoalexins elicitors, vanadate and elevation of medium pH [J].PlantCellandPhysiology, 1985, 26(6): 1 101-1 110.

[26]HAGENDOORN M J M, TRAAS T P, BOON J J,etal. Orthovanadate induced lignin production, in batch and continuous cultures ofPetuniahybrida[J].JournalofPlantPhysiology, 1990, 137(1): 72-80.

[27]ZHANG C H, MEI X G, LIU L,etal. Enhanced paclitaxel production induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures ofTaxuschinensis[J].BiotechnologyLetters, 2000, 22(19): 1 561-1 564.

[28]PITTA-ALVAREZ S I, SPOLLANSKY T C, GIULIETTI A M. The influence of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane alkoids in hairy root cultures ofBrugmansiacandida[J].EnzymeMicrobialTechnology, 2000, 26(2-4): 252-258.

[29]GE X, WU J. Tanshinone production and isoprenoid pathways inSalviamiltiorrhizahairy roots induced by Ag+and yeast elicitor [J].PlantScience, 2005, 168(2): 487-491.

[30]BEYER JR E M. A potent inhibitor of ethylene action in plants [J].PlantPhysiology, 1976, 58(3): 268-271.

[31]BINDER B M. The ethylene receptor: complex perception for a simple gas [J].PlantScience, 2008, 175(1-2): 8-17.

[32]游玉華, 張朝平. 組氨酸和銀離子間的相互作用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010, 14(29): 5 498-5 504.

YOU Y H, ZHANG C P. Interaction between silver ions and histidine [J].JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch, 2010, 14(29): 5 498-5 504.

[33]游玉華, 張朝平. 色氨酸-銀納米微粒的制備與表征[J]. 廣東化工, 2010, 37(3): 76-78.

YOU Y H, ZHANG C P. Preparation and characterization of Trp-Ag nanoparticles [J].GuangdongChemicalIndustry, 2010, 37(3): 76-78.

[34]申德君, 游玉華, 張朝平. 光譜考察L-亮氨酸和銀(I)離子的反應(yīng)[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008, 12(3): 7 071-7 075.

SHEN D J, YOU Y H, ZHANG C P. Spectra analysis of the interaction between leucine and silver(I) ion [J].JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch, 2008, 12(3): 7 071-7 075.

[35]張少穎, 饒景萍. Ca2+參與NO對切花月季瓶插期間乙烯合成的調(diào)控[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(13): 82-87.

ZHANG S Y, RAO J P. Involvement of Ca2+in ethylene biosynthesis of cut rose during vasing regulated by nitric oxide [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2009, 25(13): 82-87.

[36]WILSON M T, TORRES J. Reactions of nitric oxide with copper containing oxidases; cytochrome coxidase and laccase [J].IUBMBLife, 2004, 56(1): 7-11.

[37]SHIGEOKA S, ISHIKAWA T, TAMOI M,etal. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes [J].JournalofExperimentalBotany, 2002, 53(372): 1 305-1 319.

[38]COETZER C, CORSINI D, LOVE S,etal. Control of enzymatic browning in potato (SolanumtuberosumL.) by sense and antisense RNA from tomato polyphenol oxidase [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry, 2001, 49(2): 652-657.

[39]SAPERS G M, ZIOLKOWSKI M A. Comparison of erythorbic and ascorbic acid as inhibitors of enzymatic browning in apple [J].JournalofFoodScience, 1987, 52(6): 1 732-1 733.

[40]HUS A F, SHIEH J J, BILLS D D,etal. Inhibition of mushroom polyphenol oxidase by ascorbic acid derivatives[J].JournalofFoodScience, 1988, 53(3): 765-767.

[41]DING C K, CHACHIN K, UEDA Y,etal. Inhibition of loquat enzymatic browning by sulfhydryl compounds [J].FoodChemistry, 2002, 76(2): 213-218.

[42]RICHARD-FORGET F C, GOUPY P M, NICOLAS J J. Cysteine as an ihibitor of enzymatic browning. 2. Kinetic studies [J].JournalofAgricultureandFoodChemistry, 1992, 40(11): 2 108-2 113.

[43]HAHN M G, ALBERSHEIM P. Host-pathogen interactions XIV. Isolation and partial characterization of an elicitor from yeast extract [J].PlantPhysiology, 1978, 62(1): 107-111.

[44]DIXON R A, PAIVA N L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism [J].PlantCell, 1995, 7(7): 1 085-1 097.

(編輯:宋亞珍)

Cloning of Polyphenol Oxidase Gene fromSalviamiltiorrhizaHairy Roots and Its Expression Analysis

SHI Wangke, SUN Yiyue, SHU Zhiming, ZHANG Yuejin, LIANG Zongsuo, GUO Hongbo*

(State Key Laborotary of Stress Biology in Arid Areas, State and Local Joint Research Center of TCM Fingerprint and Natural Products, College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling，Shaanxi 712100, China)

The polyphenol oxidase (PPO) was found to positively regulate the accumulation of salvianolic acid B (SAB). This investigation further clone its cDNA sequence from hairy roots ofSalviamiltiorrhizaby using RACE technique (named asSmPPO, GenBank accession No. KF712274). The full length cDNA ofSmPPOwas 1 930 bp with a 1 770 bp open reading frame, encoding a protein of 589 amino acids. Two N-glycosylation sites were found in N-terminus thylakoid transfer domain, when comparing the amino acid sequences ofSmPPOto other PPOs in Tubiflorae. Expression analysis of real-time PCR indicated that PPO transcript levels significantly increased in yeast extract (YE)-elicited hairy roots, whereas it significantly decreased in the Ag+, ascorbic acid and cysteine treatments. Correspondingly, the accumulation of SAB was significantly increased in YE-treatment hairy roots, and was inhibited by the three elicitor treatments. These results suggest thatSmPPOgene positively regulates the accumulation of SAB.

Salviamiltiorrhiza; polyphenol oxidase; gene clone; cDNA sequence; gene expression

1000-4025(2016)09-1735-08doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1735

2016-06-12;修改稿收到日期:2016-08-04

國家自然科學(xué)基金(81373908);陜西省自然科學(xué)基金(2015JM3092; 2016JM8108);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費 (2452016003)

時王珂(1993-)，女，在讀碩士研究生，主要從事逆境對藥用植物育性影響方面的研究。E-mail: lyshiwangke@gmail.com

郭宏波，博士，副教授，主要從事丹參雄性不育的分子機制的研究。E-mail: hbguo@nwsuaf.edu.cn

Q785; Q789

A