張水明，涂佳麗，阿不都熱扎克·依沙克,李川微，戶　倩，陳　磊，董麗麗*

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036; 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 觀賞園藝與園林系，北京 100193)

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桂花查爾酮異構(gòu)酶OfCHI基因的克隆與表達(dá)分析

張水明1，涂佳麗1，阿不都熱扎克·依沙克2,李川微1，戶倩1，陳磊1，董麗麗1*

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036; 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 觀賞園藝與園林系，北京 100193)

查爾酮異構(gòu)酶CHI是花青素苷合成途徑中的關(guān)鍵酶。為了解桂花花青苷的合成機(jī)理，該研究對(duì)3個(gè)桂花品種的花青苷含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示：(1)‘橙紅丹桂’花中的花青苷含量最高，‘金桂’和‘早銀桂’中花青苷含量較低。 (2)利用RACE和RT-PCR方法獲得了桂花查爾酮異構(gòu)酶基因(OfCHI)的全長(zhǎng)cDNA序列1 069 bp，該基因編碼248個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為26.85 kD，等電點(diǎn)為6.34。(3)多重序列比對(duì)顯示，OfCHI與金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI的相似性分別為68.13%、65.86%和63.53%，氨基酸序列中含有CHI蛋白的活性位點(diǎn)Thr47、Tyr108、Met115以及 Ser192；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，OfCHI與其他物種起源相同，而與油橄欖OeCHI親緣關(guān)系最近。(4)利用qRT-PCR對(duì)不同桂花品種、不同組織中OfCHI的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，OfCHI在‘橙紅丹桂’花中表達(dá)量最高，在‘金桂’和‘早銀桂’中表達(dá)量較低；OfCHI在‘橙紅丹桂’、‘金桂’和‘早銀桂’的花、莖、葉中均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)相同，均為葉中表達(dá)量最高。該研究為揭示桂花青素苷的合成機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)，并為培育不同花色的桂花新品種提供了基因?qū)＠?/p>

桂花；花青苷；OfCHI；表達(dá)分析

桂花 (OsmanthusfragransLour.)又名木犀,是中國十大傳統(tǒng)名花之一[1]，其花色豐富，主要有以丹桂為主的橙紅色、以金桂為主的黃色，以及以銀桂和四季桂為主的淡黃色。桂花中的色素主要是類胡蘿卜素和類黃酮兩大類，而參與花色形成的類黃酮主要有花青苷和2-苯甲川基苯呋喃酮，花青苷所占的比例很大程度上能夠決定花的最終顏色[2]。

花青苷的生物合成途徑已經(jīng)得到了較為深入的研究，苯丙氨酸作為花青苷生物合成的前體，在苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanine ammonia-lyase，PAL)的調(diào)控下生成4-香豆酰輔酶A(4-Coumaroyl-CoA，4CL)，后經(jīng)查爾酮合成酶 (chalcone synthase，CHS)的催化生成查爾酮，而查爾酮異構(gòu)酶 (chalcone isomerase，CHI)隨后將黃色的查爾酮催化成無色的黃烷酮 (flavanvone)，黃烷酮進(jìn)一步在黃烷酮羥化酶 (flavonoid 3-hydroxylase，F(xiàn)3H)和二氫黃酮醇還原酶 (dihydroflavonol reductase，DFR)催化下形成無色花色素，最后在花色素合成酶 (anthocyanidin synthase，ANS)、糖基轉(zhuǎn)移酶 (glucosyl transferase，GT)等的作用下形成各種花青苷[3]。其中CHI是花青苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，它能夠使催化雙環(huán)的查爾酮為三環(huán) (2S)-黃烷酮的效率提高107倍[4]。CHI基因首先從豌豆中分離得到[5]，隨后陸續(xù)在矮牽牛 (Petuniahybrida)[6]、菜豆 (Phaseolusvulgaris)[7]、玉米 (Zeamays)[8]、豌豆 (Pisumsativum)[9]、紫花苜蓿 (Medicagosativa)[10]、水稻(Oryzasativa)和大麥(Hordeumvulgare)[11]等多種植物中被鑒定。研究發(fā)現(xiàn)植物中存在2種類型的CHI：Ⅰ型CHI能夠?qū)?-羥基查爾酮催化生成5-羥基黃烷酮，Ⅱ型CHI目前僅在豆目植物中被發(fā)現(xiàn)，能夠?qū)?-羥基查爾酮和6-脫氧查爾酮分別催化生成5-羥基黃烷酮和5-脫氧黃烷酮[12-13]。不同物種中CHI基因的表達(dá)特性不同：矮牽牛CHI-A基因主要在花冠及成熟花藥中表達(dá)，CHI-B主要在未成熟花藥中表達(dá)[6]。葡萄VvCHI基因在果皮、果肉和種子中都有表達(dá)[14]，而苜蓿MsCHI基因在根尖和幼根中表達(dá)量較高，在子葉和花中表達(dá)量較低[15]。矮牽牛CHI啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域的突變導(dǎo)致花粉顏色變?yōu)辄S色或綠色[16]。CHI基因表達(dá)量的改變能夠引起類黃酮含量的變化，例如：將矮牽牛的CHI-A基因在番茄中異源表達(dá)，導(dǎo)致果皮中黃酮類物質(zhì)增加78倍，果肉中黃酮醇增加21倍[17]。銀杏GbCHI活性的增加引起銀杏葉片中總黃酮含量的增加[18]。甘草CHI轉(zhuǎn)錄水平和CHI活性的升高導(dǎo)致黃酮類化合物的積累[19]。

本研究以‘橙紅丹桂’、‘金桂’、‘早銀桂’為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定了3個(gè)桂花品種的花青苷含量；同時(shí)，利用RACE技術(shù)克隆了OfCHI的cDNA全長(zhǎng)序列，利用RT-PCR技術(shù)分析了CHI基因在不同品種、不同組織中的表達(dá)特性。該研究為后續(xù)在分子水平研究桂花中花青苷的合成及培育不同花色桂花新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

以合肥植物園內(nèi)樹齡約20年的‘橙紅丹桂’、‘金桂’及‘早銀桂’為材料。于2015年10月9日，采集新生嫩莖、枝條頂端葉片及開放第2天的花瓣，浸于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2方法

1.2.1花青素苷含量的測(cè)定采用pH示差法[20]對(duì)不同桂花品種花朵的花青苷進(jìn)行測(cè)定：取混合樣品用液氮研磨，稱取1 g于三角瓶中，加入1%HCl定容至50 mL浸提，至無色后過濾；分別取浸提液2 mL，用0.4 mol/L pH 1.0的 KCl-HCl緩沖溶液和0.4 mol/L pH 4.5的醋酸鈉緩沖溶液稀釋至5 mL，混勻后室溫放置20 min；以蒸餾水作為對(duì)照，在510和700 nm下測(cè)定光密度值，重復(fù)3次。

表1　本實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 1　Primers used in this study

花色素苷含量 (mg/g)=△A×2.5×0.05×1 000×449.2/(26 900×1)，其中：△A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5，公式中2.5、0.05、449.2、26 900和1分別對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)、浸提液體積 (L)、矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(g/mol)、矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數(shù) (L·mol-1·cm-1)及樣品質(zhì)量。

1.2.2基因全長(zhǎng)序列的克隆以‘金桂’花瓣為材料，使用艾德萊RNA試劑盒提取RNA，以去除DNA后的RNA為模板，使用M-MLV (Promega) 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的其他物種CHI的序列，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲取基因的中間片段。在中間片段序列上設(shè)計(jì)特異引物，使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)分別獲得5′和3′端序列。將三部分序列進(jìn)行拼接，最終獲得基因的全長(zhǎng)序列。使用TransStart?FastPfuFly(全式金公司)高保真聚合酶擴(kuò)增目的基因，加A反應(yīng)后連接到pGEM-Teasy 載體，由上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，共 32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。

1.2.3基因的生物信息學(xué)分析利用DNAMAN 2.6將基因編碼的氨基酸序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中的其它物種的同源序列進(jìn)行比對(duì)；運(yùn)用ExPASy-Protparam Tool (http://web.expasy.org/protparam)分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；運(yùn)用Psort prediction (http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用ClustalX 1.8和MEGA 5.05軟件構(gòu)建最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹，并設(shè)置Bootstrap 重復(fù)分析1 000次。

1.2.4基因表達(dá)分析利用艾德萊RNA試劑盒提取不同樣品的RNA，分別取2 μg經(jīng)過DNase I(TaKaRa)消化的RNA，使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara)試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)獲得的基因全長(zhǎng)序列，使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物OfCHI-F/OfCHI-R(表1)。以不同樣品的cDNA為模板，采用Actin基因作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq10 μL，ROX Peference Dye 0.4 μL，模板2 μL，正反向引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，總體系為20 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析使用ABI7500軟件(Version 2.0.4), 相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCt方法[21]。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003、DPS7.05、Agilent 1100 offline studio軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同桂花品種花青苷含量分析

對(duì)不同桂花品種花瓣中花青苷含量的檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示：‘橙紅丹桂’的花青苷含量最高，為15.7 mg·g-1，‘金桂’與‘早銀桂’的花青苷含量較低，分別為1.9和0.6 mg·g-1?！燃t丹桂’花青苷含量與‘金桂’和‘早銀桂’差異性均達(dá)到顯著水平，而‘金桂’、‘早銀桂’之間的差異性不顯著。‘橙紅丹桂’花中花青苷含量高，其花色呈明亮的橙紅色，而‘金桂’和‘早銀桂’花青苷含量少，其花色呈黃色和淡黃色。該結(jié)果表明花青苷含量與桂花花色深淺呈正相關(guān)。

2.2桂花CHI基因的克隆

根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的其他物種的CHI序列，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到一個(gè)400 bp的核酸片段(圖2)。將該片段序列與橄欖 (Oleaeuropaea)的OeCHI序列進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)95%，初步判斷該片段為桂花OfCHI基因片段。根據(jù)已獲得的中間片段序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增3′端、5′端的特異性引物。利用UPM-Long和CHI-3′GPS1引物進(jìn)行CHI3′端第1輪擴(kuò)增，以此PCR產(chǎn)物為模板，使用NUP和CHI-3′GPS2引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，獲得CHI635 bp 3′端序列(圖2，2)。利用通用引物UPM Long和特異引物CHI-5′GPS1進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，并以此PCR產(chǎn)物為模板，使用NUP與CHI-5′GPS2作為引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，獲得CHI403 bp 5′端序列。將獲得的三部分序列進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)引物CHI-QC-F/CHI-QC-R，利用高保真酶進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，最終得到1 069 bpOfCHI基因序列(登錄號(hào)KR81581)，其中包含5′-RACE 96 bp、3′-RACE 226 bp和開放閱讀框747 bp，該基因編碼248個(gè)氨基酸。

小寫字母表示不同品種間花青苷含量的差異顯著性(P<0.05)圖1　3種桂花品種花青苷含量The different normal letters indicate significant difference of anthocyanin contents among O.fragrans cultivars(P<0.05)Fig.1　Anthocyanin contents of three O.fragrans cultivars

2.3生物信息學(xué)分析

通過Protparam分析CHI蛋白理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白分子式為C1207H1885N311O371S5，相對(duì)分子量為26.85 kD，等電點(diǎn)為6.34。該蛋白中相對(duì)含量最多的氨基酸是絲氨酸 Ser (S，11.2%，28個(gè))，相對(duì)含量最少的氨基酸是半胱氨酸Cys (C，0.8%)和色氨酸Trp (W，0.8%)。脂肪族氨基酸指數(shù)76.02，總平均疏水指數(shù) (GRAVY)為-0.192，該蛋白為親水性蛋白。

將OfCHI編碼的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)OfCHI與金花茶的CnCHI蛋白相似性最高(圖3)，達(dá)到68.13%。與忍冬LjCHI、石榴PgCHI相似性分別為65.86%、63.53%。序列分析顯示，OfCHI氨基酸序列上存在CHI蛋白的激活位點(diǎn)Arg 38、Gly39、Leu40、 Phe49、Thr50、Tyr108、Lys111、Val112、Asn115及 Cys116[22]。

2.4OfCHI同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定OfCHI與其他物種CHI的親緣關(guān)系，利用MEGA 5.05軟件，將OfCHI與已克隆的橄欖、金花茶和忍冬等11個(gè)物種的CHI進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖4)。結(jié)果顯示，OfCHI與其他物種的CHI起源相同，但在后來進(jìn)化的不同時(shí)期，與其他物種分離開來。OfCHI和橄欖OeCHI的親緣關(guān)系最近，聚為一支，而與牡丹PsCHI和芍藥PiCHI的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖 4)。

M.DL2000；1. 中間片段產(chǎn)物；2. 3′-RACE；3. 5′-RACE圖2　OfCHI基因擴(kuò)增結(jié)果M. DL2000；1. Internal fragments；2. 3′-RACE；3. 5′-RACEFig.2　PCR amplification results of OfCHI

PsCHI. 牡丹 (AEK70330.1); PICHI. 芍藥 (AEK32592.1); CnCHI. 金花茶 (ADZ28513.1); SbCHI. 黃芩 (ADQ13184.1); RrCHI. 玫瑰 (AKT71851.1); PcCHI. 西洋梨 (AGL50916.1)；MnCHI. 桑 (AHY35310.1). PgCHI. 石榴 (AHZ97871.1)；LjCHI. 黑果枸杞 (AHH86092.1); LrCHI. 忍冬(AGE10599.1); OeCHI. 油橄欖(AHI86005.1)圖4　不同物種CHIs的系統(tǒng)進(jìn)化分析PsCHI. Paeonia suffruticosa (AEK70330.1); PICHI. Paeonia lactiflora (AEK32592.1); CnCHI. Camellia nitidissima (ADZ28513.1); SbCHI. Scutellaria baicalensis (ADQ13184.1); RrCHI. Rosa rugosa (AKT71851.1); PcCHI. Pyrus communis (AGL50916.1)；MnCHI. Morus notabilis (AHY35310.1); PgCHI. Punica granatum (AHZ97871.1); LjCHI. Lonicera japonica (AHH86092.1); LrCHI. Lycium ruthenicum (AGE10599.1); OeCHI. Olea europaea(AHI86005.1)Fig.4　Phylogenetic analysis among different CHIs

小寫字母表示不同品種間OfCHI基因表達(dá)的差異顯著性(P<0.05)圖5　不同桂花品種中OfCHI的相對(duì)表達(dá)量The different lowercase letters indicate significant difference of OfCHI expression among O.fragrans cultivars(P<0.05)Fig.5　Relative expression of OfCHI in different osmanthus cultivars

小寫字母表示不同品種、不同組織間花青苷含量的差異顯著性(P<0.05)圖6　桂花不同組織中OfCHI的相對(duì)表達(dá)量The different lowercase letters indicate significant difference of OfCHI expression of different O.fragrans cultivars and tissues(P<0.05)Fig.6　Relative expression of OfCHI in different tissues of osmanthus

2.5不同桂花品種中OfCHI基因的表達(dá)分析

對(duì)OfCHI在不同桂花品種中的表達(dá)特性進(jìn)行分析，結(jié)果(圖5)顯示，OfCHI在‘橙紅丹桂’中表達(dá)量最高，在‘早銀桂’，‘金桂’中表達(dá)量較低。OfCHI在‘金桂’與‘早銀桂’中表達(dá)量分別為‘橙紅丹桂’的0.39和 0.46倍?！燃t丹桂’表達(dá)量與‘金桂’和‘早銀桂’表達(dá)量差異顯著，而‘金桂’、‘早銀桂’之間差異不顯著。結(jié)合圖1中‘橙紅丹桂’花青苷含量明顯高于‘金桂’和‘早銀桂’的結(jié)果，表明OfCHI表達(dá)量和花青苷含量呈正相關(guān)。

2.6不同組織中OfCHI基因的表達(dá)分析

對(duì)‘橙紅丹桂’、‘早銀桂’和‘金桂’3個(gè)桂花品種不同器官中OfCHI的表達(dá)特性進(jìn)行分析,結(jié)果(圖6)顯示：3個(gè)桂花品種中，OfCHI的組織特異性表達(dá)趨勢(shì)相似，均表現(xiàn)為在葉片中表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低。葉中表達(dá)量與花和莖的差異均達(dá)到顯著水平，而花和莖之間差異性不顯著。此外，‘橙紅丹桂’花、葉、莖中OfCHI的表達(dá)量均高于‘早銀桂’和‘金桂’，這與圖5結(jié)果一致。

3　討　論

花青素苷是一種類黃酮類天然色素，存在于絕大部分植物的液泡中，能使植物花瓣呈現(xiàn)橙、紅、紫、藍(lán)等色彩[23]。本研究通過分析3種桂花的花青苷含量與花色的關(guān)系發(fā)現(xiàn),‘橙紅丹桂’花中花青苷積累較多，其花色呈明亮的橙紅色，而‘金桂’和‘早銀桂’花青苷含量少，其花色呈黃色和淡黃色，花色差異不明顯。這與陳洪國等的研究相一致：著色較深的‘軟葉丹桂’花青素的含量比‘四季桂’和‘柳葉銀桂’高2～3倍[24]。以上研究表明花青苷的含量能夠決定桂花的顏色深淺。

查爾酮異構(gòu)酶CHI是花青素苷合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。研究發(fā)現(xiàn)CHI活性的升高能夠使花青苷含量增加[25]，說明CHI是花青素合成途徑中的重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)。本研究從桂花中克隆了OfCHI

基因，序列比對(duì)顯示OfCHI與金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI相似性介于63%～68%之間，這與不同物種間CHI高度的保守性 (49%～82%)相符合[26]。該基因推定的氨基酸序列含有的CHI蛋白保守域與百脈根 (Lotusjaponicus)中Ⅱ型CHI1相同[22]，說明OfCHI的確是CHI的同源基因。而鑒于CHI II型僅在豆目植物中存在，因此OfCHI屬于Ⅰ型CHI蛋白。

研究表明改變CHI的表達(dá)量能夠最終引起植物花色的改變，例如：抑制翠菊、仙客來和康乃馨中CHI的表達(dá)，花瓣中查爾酮含量升高，花朵變?yōu)辄S色[27-29]；抑制煙草CHI的表達(dá)，植株中黃酮含量降低，花粉及花瓣中顏色變淺[30]。為研究桂花OfCHI表達(dá)量與花色及花青苷含量之間的關(guān)系，對(duì)不同花色桂花OfCHI的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OfCHI在花色橙紅、花青苷含量較高的‘橙紅丹桂’中的表達(dá)量最高，在花色呈黃色和淡黃色、花青苷含量較低的‘早銀桂’，‘金桂’中的表達(dá)量較低。上述研究表明OfCHI的表達(dá)量不同決定花青苷含量不同，最終導(dǎo)致植物花色的差異。

CHI的表達(dá)具有組織特異性，且不同物種中表達(dá)模式并不相同。CHI在紅肉臍橙中表現(xiàn)為根>莖>果皮>葉，在‘國慶四號(hào)’溫州蜜柑中表現(xiàn)為葉>幼果皮>根>莖>幼果肉[31]；花生AhCHII在‘中花9’中表現(xiàn)為種皮>根>葉>花>莖，在‘GX029’中表現(xiàn)為葉>種皮>根>莖，在LH14中表現(xiàn)為種皮>花>莖>葉>根[32]。對(duì)桂花中不同組織中OfCHI的表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)，OfCHI在桂花的花、莖、葉中均有表達(dá)，葉片中表達(dá)量最高，花中表達(dá)量最低，且3個(gè)桂花品種趨勢(shì)相同。這與其他物種中的表達(dá)特性不完全相同，這可能是因?yàn)椴煌锓N中OfCHI的功能并不完全相同。

綜上所述，本研究從桂花中分離了OfCHI基因，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了分析,為后續(xù)探討桂花花青素苷的合成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，并為開展桂花花色改良的分子育種提供了基因?qū)＠蛥⒖假Y料。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis of Chalcone IsomeraseOfCHIfromOsmanthusfragrans

ZHANG Shuiming1，TU Jiali1, ABDURAZAK·Isha2, LI Chuanwei1,HU Qian1, CHEN Lei1, DONG Lili1*

(1 College of Horticulture，Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China)

Chalcone isomerase CHI is a key enzyme in the biosynthesis pathway of anthocyanin. In order to understand the synthesis mechanism of anthocyanin inO.fragrans, we detected the anthocyanin content of threeO.fragranscultivars in this study. The results showed that: (1) the anthocyanin content in ‘Chenghongdangui’ was the highest, while lower in ‘Jingui’ and ‘Zaoyingui’. (2) The full-length cDNA sequence ofOfCHI(1 069 bp) was obtained by using RACE and RT-PCR methods.OfCHIencoded a deduced protein of 248 amino acids, with the relative molecular weight of 26.85 kD and isoelectric point of 6.34. (3) Multiple sequence alignment showed thatO.fragranshad 68.13%, 65.86% and 63.53% similarity withCamellianitidissima,PunicagranatumandLonicerajaponica, respectively. OfCHI contained the active sites of ChI protein: Thr47, Tyr108, Met115 and Ser192. Phylogenetic tree analysis showed that OfCHI shared the same origin with other species, and had the closest relationship withOleaeuropaeaOeCHI. (4)OfCHIexpression was detected in different cultivars and tissues using qRT-PCR. The results showed thatOfCHIexpression level was the highest in‘Chenghongdangui’, while lower in ‘Jingui’ and ‘Zaoyingui’.OfCHIexpression was detected in flowers, stems and leaves of ‘Chenghongdangui’, ‘Jingui’ and ‘Zaoyingui’, and showed the same expression trend with the highest expression level in leaves. The study provides not only theoretical basis for the synthesis mechanism of anthocyanin in osmanthus, but also gene patent for developing new osmanthus cultivars of different flower color.

Osmanthus; anthocyanin;OfCHI; expression analysis

1000-4025(2016)09-1728-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1728

2016-06-14;修改稿收到日期:2016-09-07

國家自然科學(xué)基金(30900971)

張水明(1974-)，男，博士，副教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail: zhangshm893@sohu.com

董麗麗，博士，講師， 主要從事花卉分子育種研究。E-mail: dongli0608@163.com

Q785; Q786

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