徐惠娟，鄭　蕊，陳　任，王彥才，王麗娟

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川750021)

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枸杞WRKY3基因克隆及組織表達分析

徐惠娟，鄭蕊，陳任，王彥才，王麗娟*

(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川750021)

以枸杞為材料， 采用PCR及RACE方法，克隆了枸杞WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因 cDNA序列，命名為LbWRKY3，GenBank登錄號為 KX196192。 在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進行亞細胞定位、基因表達分析。結(jié)果顯示：(1)LbWRKY3開放閱讀框ORF長度為1 068 bp， 編碼356個氨基酸。(2)生物信息學(xué)分析顯示，LbWRKY3編碼蛋白具有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，二級結(jié)構(gòu)中不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最大(58.67%)，延伸鏈結(jié)構(gòu)次之(18.88%)，α螺旋比例為15.82%，β轉(zhuǎn)角最少，僅為 6.63%； Lb WRKY3蛋白與案頭菊WRKY蛋白、黃花蒿WRKY蛋白相似性較高。(3) 亞細胞定位顯示，Lb WRKY3蛋白定位于細胞核。 (4)實時定量PCR分析表明，LbWRKY3在根中表達量最高，在花中表達量最低； 在枸杞果實發(fā)育過程中LbWRKY3均有表達，表達量隨果實成熟逐漸升高，并于35 d達到峰值；LbWRKY3基因在果實中的表達具有組織特異性表達特性(果肉>果皮>種子)。研究表明，LbWRKY3基因參與了枸杞果實生長發(fā)育調(diào)控。

枸杞；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；果實發(fā)育；表達模式

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中有75個成員，水稻中有109個成員，由于其N-末端含有高度保守的WRKYGQK 氨基酸序列而得名。1994年Ishiguro和Nakamura在甘薯中發(fā)現(xiàn)了第一個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1， 隨后其他研究者又相繼在野燕麥、歐芹、擬南芥、番茄、棉花、煙草、辣椒等多種植物[1-2]中發(fā)現(xiàn)該類轉(zhuǎn)錄因子。

WRKY是一種誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)因子，N-端含有7個絕對保守的氨基酸序列(WRKYGQK)及鋅指結(jié)構(gòu)(CX4-7CX22-23HXH/C)，能夠通過與核心序列為 (T)(T)TGAC(T/C)的W-box 順式元件特異結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的表達。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型可分為3類。其中第Ⅰ類與第Ⅱ類都含有相同的鋅指結(jié)構(gòu)C2H2。第Ⅰ類含2個WRKY結(jié)構(gòu)域，如最早識別的WRKY蛋白IbSPF1、CsSE71[3]等。第Ⅱ類只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，包括了大多數(shù)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。 第Ⅲ類也只含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，但其鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型，這類轉(zhuǎn)錄因子只存在于高等植物中。

最初的研究認為，WRKY基因參與植物糖信號途徑的建立和染色質(zhì)重塑[4]。隨后研究表明，WRKY基因在植物生長發(fā)育和各種生理過程中均起到重要的調(diào)節(jié)作用，包括胚胎發(fā)育、種皮和毛狀體發(fā)育以及植物衰老，生物合成調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等。此外，各種生物脅迫與非生物脅迫亦能誘導(dǎo)WRKY轉(zhuǎn)錄因子表達，使其廣泛參與植物的各種脅迫應(yīng)答[5]。

枸杞(LyciumbarbarumL.)屬茄科，多年生落葉小灌木 (2n=24)。其果實被稱為枸杞子(Fructuslycii)，棗核大小，色澤鮮紅，味道甜美，果肉柔潤，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有補腎養(yǎng)肝、潤肺明目之功效。糖是枸杞果實的重要組分，其種類、含量直接影響著枸杞果實的藥用價值、風味口感、色澤等品質(zhì)性狀。枸杞果實發(fā)育的過程中，糖的含量和組成不斷變化，尤其蔗糖、葡萄糖和果糖對果實品質(zhì)形成起重要作用[6-7]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控果實發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，然而其對枸杞果實的調(diào)控研究尚未見報道。本研究以‘寧杞1號’為研究材料，分離WRKY類轉(zhuǎn)錄因子，并對其進行序列和表達分析，為揭示枸杞品質(zhì)形成的分子調(diào)控機制積累研究資料，為提高枸杞果實的產(chǎn)量和質(zhì)量提供一些新的切入點。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為5年生‘寧杞1號’枸杞，種植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所實驗田，常規(guī)栽培管理。于2015年8月，果實材料的收集參照王麗娟等[8]的方法，同時采集成熟根、成熟莖、成熟葉、成熟花，不同的器官均重復(fù) 3 次，取樣后于液氮中速凍后，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1RNA提取和反轉(zhuǎn)錄按照植物總RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書要求，分別取0.01 g枸杞根、莖、葉、花、果實提取總RNA， 取0.8 μg總RNA ，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明，將提取RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。

1.2.2LbWRKY3基因全長的克隆利用Dnaman 6.0軟件分析已知物種WRKY基因的核苷酸序列， 在保守區(qū)域設(shè)計引物。正向引物FF-LbWRKY3(5′-CACAGTTGGAGAAAGTATGGAC-3′)，反向引物 RF-LbWRKY3(5′-AAAGGTGGCGAATAGACTTGC-3′)，以逆轉(zhuǎn)錄果實cDNA 為模板擴增枸杞WRKY基因保守片段。反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s； 58 ℃ 30 s； 72 ℃ 40 s。30 個循環(huán)后72 ℃ 10 min。回收目的片段，連接到pGM-T Easy載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落 PCR 檢測后，隨機選取3個獨立的陽性克隆進行測序 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

根據(jù)基因特異引物PCR擴增得到的同源保守序列，依據(jù)RACE操作手冊分別設(shè)計3′-RACE、5′-RACE引物(表1)，并按要求逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA 第一鏈。兩輪程序分別為：(1)94 ℃ 30 s，71 ℃ 2.5 min，重復(fù) 6 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 40 s，73 ℃ 3 min，重復(fù) 6 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，73 ℃ 2 min，25 個循環(huán)；(2)95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30 個循環(huán)，73 ℃ 5min。分別對 PCR 擴增條帶檢測、回收和測序。依據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計1對全長引物，擴增LbWRKY3的 ORF 閱讀框，引物分別為 F-LbWRKY3和R-LbWRKY3(表1)。

1.2.3編碼蛋白的生物信息相關(guān)分析Lb WRKY3編碼蛋白理化相關(guān)性質(zhì)的分析采用 Protparam 工具 (http://web.expasy.org/protparam/)；采用SOMPA(http://www.expasy.ch/tools)和 Phyre2 在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/)分別對 Lb WRKY3編碼蛋白進行二級結(jié)構(gòu)與三維結(jié)構(gòu)分析；分泌蛋白和蛋白定位信號預(yù)測分析分別使用 SignalP4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和 ProtComp v. 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)。通過NCBI 搜索下載 Lb WRKY3氨基酸同源序列，通過DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4亞細胞定位(1) 載體構(gòu)建利用得到的枸杞LbWRKY3全長ORF序列，通過引物引入2個酶切位點BamH I 和KpnI，并將擴增片段連入pMD19-T載體。經(jīng)過藍白斑篩選，對陽性克隆進行測序驗證。 提取正確T載體克隆的質(zhì)粒，雙酶切得到目標基因片段，構(gòu)建pCAMBIA1301-GFP 載體，將GFP與Lb WRKY3蛋白C端融合，得到Lb WRKY3-GFP 融合蛋白，并通過35S啟動子，增強融合蛋白的表達。該載體用于基因槍洋蔥表皮轟擊試驗。

(2) 基因槍洋蔥表皮轟擊實驗方法利用質(zhì)粒大抽試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取4 μg pCAMBIA1301-GFP-LbWRKY3質(zhì)粒。將所得質(zhì)粒與 50 mg/mL的金粉懸液混合，加入抽濾滅菌的4 μL亞精胺(0.1 mol/L)、 6 μL CaCl2(2.5 mol/L)后混勻，冰上靜置15 min，12 000 r/min 離心10 s，清水清洗重復(fù)3次，金粉沉淀通過12 000 r/min 離心收集，最后的金粉-質(zhì)?；旌衔锿ㄟ^20 μL無水乙醇重懸。

將洋蔥內(nèi)表皮撕取下來浸入高滲培養(yǎng)液(MS無機鹽、40 g/L甘露醇)中，室溫下處理4 h；然后轉(zhuǎn)入由MS無機鹽+40 g/L甘露醇+0.7% 瓊脂組成的高滲固體培養(yǎng)基中備用。同時將基因槍氣瓶壓力調(diào)節(jié)為1 300 psi；用 70%乙醇浸潤載體膜、可裂膜、阻攔網(wǎng)1 min，自然風干；在微粒載體膜中央添加10 μL 微粒懸浮液，晾干后轟擊備用的洋蔥表皮；材料在轟擊結(jié)束后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h；最后用激光共聚焦顯微鏡(德國Toptica公司)觀察GFP的表達，波長設(shè)置為488 nm。

1.2.5實時熒光定量PCR以枸杞持家基因LbActin為內(nèi)參，引物為F-Actin(5′-TCACACTTTCTACAATGAGCT-3′)和 R-Actin(5′-GATATCCACATCACACTTCAT-3′)，分別以稀釋50倍的反轉(zhuǎn)錄(枸杞根、莖、葉、花、果實)cDNA作為模板，采用real-time PCR檢測LbWRKY3基因在枸杞不同器官、不同發(fā)育時期果實、果實不同組織的表達量。 采用Primer Primer 5.0設(shè)計熒光定量引物。PCR擴增引物為QF-LbWRKY3(5′-ATACCGCAAGGCTGAGAAGT-3′)和QR-LbWRKY3(5′-TGTTGGTGGTGGGTTGTGT-3′)。反應(yīng)體系為：模板 cDNA 1 μL(10 ng/μL)，上下游引物分別為 0.25 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(大連寶生物工程有限公司)10 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)，每個樣品3個重復(fù)。所用儀器為 ABI 7300 Real-Time PCR 儀(美國ABI公司)，相對表達量的計算采用2-ΔΔCt方法[16]。采用SPSS19 軟件對表達量進行顯著性分析，每處理重復(fù)3次。

表1　引物列表Table 1　Primers used in this study

2　結(jié)果分析

2.1枸杞Lb WRKY3克隆

通過比對已知物種中WRKY同源基因保守區(qū)域，設(shè)計引物以枸杞果實cDNA 為模板進行擴增，得到1條特異條帶，長度約為500 bp。測序結(jié)果表明，該片段與煙草、番茄、馬鈴薯等物種的WRKY同源基因具有較高一致性，表明該片段是WRKY在枸杞中的同源基因片段。基于得到的枸杞WRKY同源基因片段，設(shè)計4 條特異引物(3′-RACE，5′-RACE)，然后進行RACE克隆。得到擴增產(chǎn)物并測序后，設(shè)計cDNA全長引物F- Lb WRKY3和 R- Lb WRKY3， 使用LATaqDNA 聚合酶擴增全長后測序。

分析測序結(jié)果，得到了1 068 bp全長cDNA序列(圖 1)。其中 4 種堿基含量分別為34.0%(A)、15.7%(G)、30.9%(T)和19.5%(C)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行檢索，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因家族的基因。將該序列命名為LbWRKY3，GenBank 登錄號為KX196192。

下劃線部分為WRKY保守結(jié)構(gòu)域；*為終止密碼子圖1　Lb WRKY3 基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列The WRKY domain is underlined; * means stop code of amino acidsFig. 1　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Lb WRKY3 in Lycium barbarum

2.2枸杞Lb WRKY3編碼蛋白特性分析

通過 DNAMAN 軟件分析顯示LbWRKY3具有一個完整開放閱讀框，編碼356個氨基酸, 含有一個WRKY保守域，編碼蛋白的分子式為C987H1486N272O309S7，分子量為22.33kD，等電點為5.52，包含帶正電殘基(Arg+Lys)為20個，帶負電殘基(Asp + Glu) 為28個。進一步分析得到，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為 40.57，脂肪系數(shù)為 59.74，平均親水性系數(shù)為-0.803。

經(jīng) CBS 服務(wù)器網(wǎng)站的 NetPhos 2.0(http:// www. Cbs. Dtu. dk/ services/ NetPhos/)對 Lb WRKY3蛋白序列進行磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)，該序列上有6個 Ser ，2個Thr和2個Tyr 可能成為蛋白激酶磷酸化位點。Signal P4.0 Server 軟件分析發(fā)現(xiàn)，Lb WRKY3蛋白不含信號肽，這與ProtComp Version 9.0 軟件預(yù)測 Lb WRKY3亞細胞定位在細胞核結(jié)果相符合。利用 SOPMA 軟件分析，發(fā)現(xiàn)Lb WRKY3蛋白二級結(jié)構(gòu)中，不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)所占比例最大，為 58.67%；延伸鏈結(jié)構(gòu)(extended strand)次之 18.88%，α螺旋比例為 15.82%；β轉(zhuǎn)角最少，僅為 6.63%。Lb WRKY3蛋白三維結(jié)構(gòu)見圖2。

2.3Lb WRKY3核酸序列比對與進化分析

Blastp蛋白比對發(fā)現(xiàn)， Lb WRKY3與案頭菊WRKY7、黃花蒿WRKY1、丹參WRKY11、番茄WRKY53、木薯WRKY39蛋白有較高相似度，均含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域。

從NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)中選取與Lb WRKY3基因編碼蛋白相似性較高的12條蛋白序列，采用DNAMAN軟件，用其內(nèi)置Neighbor-joining 法構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明，枸杞 Lb WRKY3與案頭菊WRKY7(KC615361.1) 聚在一起，分子距離最近，其次與黃花蒿WRKY1 (FJ390842.1)、 案頭菊WRKY53(KM359566.1)的分子距離也相對較近(圖3)。

2.4枸杞Lb WRKY3蛋白亞細胞定位

蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)Lb WRKY3的N端具有核定位信號肽，經(jīng)蛋白亞細胞定位ProtComp Version 9.0 軟件推測Lb WRKY3位于細胞核內(nèi)。為驗證這一推測，利用洋蔥表皮細胞瞬時表達系統(tǒng)對Lb WRKY3進行亞細胞定位研究。構(gòu)建的植物表達載體pCAMBIA1301-Lb WRKY3-GFP 中，Lb WRKY3的C末端與GFP融合(圖4，A)。質(zhì)粒DNA經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，采用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞。35S CaMV組成型啟動子能夠啟動基因在細胞中表達，可通過顯微鏡觀察報告基因的綠色熒光信號來確定Lb WRKY3在細胞中的分布。結(jié)果顯示：未與Lb WRKY3融合的35S∶GFP(陰性對照)分布于整個細胞中(圖4，A)，而Lb WRKY3∶GFP融合蛋白定位于細胞核中(圖4, B)，說明Lb WRKY3是具有細胞核定位功能的蛋白。

圖 2　Lb WRKY3 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2　Three-dimensional structure of deduced Lb WRKY3 protein

2.5Lb WRKY3的定量表達分析

2.5.1LbWRKY3的器官特異性表達分析利用實時定量PCR法分析LbWRKY3在根、莖、葉、花中的表達情況。結(jié)果表明，LbWRKY3在各器官均有表達，但表達量不同，其在根中的表達量最高，在葉和莖中的表達量次之，而在花中的表達量相對最低(圖 5)，并且不同器官表達量的差異均達到極顯著水平，這表明LbWRKY3的表達具有器官特異性。

圖3　枸杞WRKY3與其他物種 WRKY 蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig. 3　Phylogenetic evolutionary analyses of WRKY proteins from different plant species

A.陰性對照；B．35S∶GFP∶Lb WRKY3融合蛋白圖 4　枸杞WRKY3 蛋白的亞細胞定位結(jié)果A. Negative control; B. Fusion protein of 35S∶GFP∶Lb WRKY3Fig. 4　The results of subcellular location of Lb WRKY3 protein

小寫字母表示不同器官基因表達差異顯著性(P<0.05)圖 5　Lb WRKY3 在不同器官中的表達模式分析The letters indicate significant differences in different organs (P<0.05)Fig. 5　Expression pattern analysis of Lb WRKY3 in different organs

小寫字母表示枸杞果實不同發(fā)育階段基因表達差異的顯著性(P<0.05)圖 6　Lb WRKY3 在果實不同發(fā)育階段的表達The letters indicate significant differences in different growth stages of fruit (P<0.05)Fig. 6　Expression pattern of Lb WRKY3 in different growth stages of fruit

小寫字母表示果實不同結(jié)構(gòu)基因表達差異的顯著性(P<0.05)圖 7　Lb WRKY3 在果實的各個結(jié)構(gòu)中表達模式分析The letters indicate significant differences in different structures of fruit (P<0.05)Fig. 7　Analysis of Lb WRKY3 gene expression pattern in different structures of fruit

2.5.2LbWRKY3在果實發(fā)育不同階段的表達分析利用實時定量PCR法分析LbWRKY3在枸杞果實發(fā)育不同階段表達量的變化規(guī)律(圖 6)。結(jié)果表明在果實的5個發(fā)育階段，其表達量逐漸升高，在果實發(fā)育第1階段表達量最低，35 d時LbWRKY3達到峰值，并且果實發(fā)育不同階段表達量的差異均達到極顯著水平。

2.5.3LbWRKY3在成熟果實不同組織的表達分析通過分析LbWRKY3在成熟果實不同組織中的表達量，發(fā)現(xiàn)LbWRKY3在果肉中的表達量較高，果皮中的表達量次之，而在種子中的表達量則較低(圖 7)，并且成熟果實不同組織表達量的差異均達到極顯著水平。

3　討　論

本研究利用植物WRKY蛋白的保守序列通過同源克隆與RACE方法成功獲得了一個枸杞WRKY轉(zhuǎn)錄因子全長cDNA序列，命名為LbWRKY3。LbWRKY3基因編碼蛋白有1個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域， 結(jié)構(gòu)域C端具有1個C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)，與案頭菊WRKY7(ChrysanthemumxmorifoliumKC615361.1)、黃花蒿WRKY1(ArtemisiaannuaFJ390842.1)蛋白相似度較高，較為保守，屬于第二類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物形態(tài)發(fā)生，在植物體內(nèi)并非組成型表達，而是受各種環(huán)境因子的誘導(dǎo)表達，其表達具有快速瞬時等特點，同時具有組織特異性。已有研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥AtWRKY1基因主要調(diào)控植株根和花的形態(tài)建成，僅在根和花組織細胞中表達，在莖、葉和長角果組織中未見表達[9]。野生馬鈴薯ScWRKY1轉(zhuǎn)錄因子在葉中的表達水平很高，在莖和根中的表達水平很低，在胚胎形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，發(fā)育的種子中幾乎不表達，在受精后16 d左右的魚雷期胚胎中有瞬時高表達[10]。本研究發(fā)現(xiàn)LbWRKY3在枸杞根、莖、葉、花和果實中均有表達，且在根中的表達水平相對最高，在花中的表達量最低。

此外， WRKY基因參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育過程。如燕麥ABF1和ABF2參與種子萌發(fā)及萌發(fā)后生長[11]；ScWRKY1參與豆科植物種子休眠、茄屬植物胚形成[12]。擬南芥TTG2控制表皮毛的早期發(fā)育、黏液的產(chǎn)生和鞣質(zhì)合成，在表皮毛、種子內(nèi)表皮以及根的無毛體整個發(fā)育時期表達[13-14]；AtWRKY75基因受抑制后，導(dǎo)致側(cè)根的數(shù)目和長度、根毛的數(shù)目變化[15]。擬南芥AtWRKY6轉(zhuǎn)錄因子在幼葉和成熟葉片幾乎不表達，葉片衰老的發(fā)生過程中，AtWRKY6基因的表達不斷增強，調(diào)控葉片衰老的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑建立[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)LbWRKY3調(diào)控枸杞果實發(fā)育。該基因在枸杞果實發(fā)育的所有時期均檢測出表達，果實發(fā)育初期(第1階段)表達量較低，伴隨著果實生長LbWRKY3相對表達量迅速升高，果實成熟期(第5階段)達到峰值，整個過程LbWRKY3的表達呈現(xiàn)由低升高，成熟時到達最大值的趨勢。在發(fā)育成熟枸杞果實不同組織中LbWRKY3表達量差異顯著，果肉中的表達量較高，果皮中的表達量次之，而在種子中表達量則較低。

WRKY基因是植物生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)過程中的重要調(diào)節(jié)因子，改良或增強一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力來提高作物的品質(zhì)將是一種更為有效的改良作物品質(zhì)的方法和途徑[18]。分離調(diào)控多種代謝基因表達的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因，為開展植物分子育種開辟了新的途徑。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Tissue Expression Analysis ofWRKY3Gene inLyciumbarbarumL.

XU Huijuan, ZHENG Rui，CHEN Ren, WANG Yancai, WANG Lijuan*

(College of Life Science, Ningxia University, WBRPU Lab of National Education Ministry, Yinchuan 750021, China)

With wolfberry (LyciumbarbarumL.) as material, polymerase chain reaction (PCR) combined with RACE technology were used to clone a cDNA ofWRKYfrom wolfberry, named asLbWRKY3. (GenBank accession No.KX196192). Meanwhile, on the basis of bioinformatic analysis, we performed the subcellular localization assays and tissue-specific expression analysis. The results indicated that: (1)LbWRKY3has an open reading frame(ORF) of 1 068 bp, which encoded a protein of 356 amino acid residues. (2)Bioinformatic analysis indicated that Lb WRKY3protein contains the one conserved WRKY motifs, the predictive secondary structure showed that Lb WRKY3protein was made up of 15.82% alpha-helix, 6.63% beta-turn, 18.88% extended strand and 58.67% random coil. Lb WRKY3protein showed the highest homology identity with WRKY protein fromChrysanthemumxmorifoliumandArtemisiaannua. (3)Subcellular localization assays showed that the Lb WRKY3protein was located in the nucleus. (4)Real-time PCR analysis indicated thatLbWRKY3was expressed in high transcript level in roots, low levels in flower. TheLbWRKY3gene expression could be detected during the whole period of fruit development. Interestingly,LbWRKY3gene showed a high transcription level in 35 days. The expression level in the pulp was higher than that in the seed and peel .LbWRKY3gene takes part in fruit development and sugar accumulation in wolfberry.

wolfberry; WRKY transcription factors; fruit development; expression pattern

1000-4025(2016)09-1721-07doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.09.1721

2016-05-30;修改稿收到日期:2016-08-23

國家自然科學(xué)基金(31260065, 31360363); 2013年中國科學(xué)院西部之光項目

徐惠娟(1979-)，女，碩士，講師，主要從事植物分子生理生態(tài)研究。E-mail：xu_hj@nxu.edu.cn

王麗娟，博士，副教授，主要從事植物基因工程研究。E-mail：mnn717@163.com

Q785；Q789

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