張譯元，唐 紅，郭延華，王新華，王立民，周 平

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子　832000)

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綿羊胚胎不同發(fā)育階段及其組織中MicroRNA-483-5p表達(dá)分析

張譯元，唐 紅，郭延華，王新華，王立民，周 平

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點實驗室，新疆石河子832000)

【目的】研究MicroRNA(miR)483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達(dá)變化，以了解其在綿羊胚胎發(fā)育中的重要作用?！痉椒ā窟x擇中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育時期(45、85、115和135 d 4個時期)腎臟和臍帶組織為研究材料，采用半定量RT-PCR檢測第45 d 綿羊胚胎不同組織中miR-483-5p的表達(dá)；同時利用實時熒光定量 PCR對miR-483-5p在綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織的表達(dá)變化進(jìn)行實時檢測?！窘Y(jié)果】miR-483-5p在所檢測的綿羊45 d胚胎各組織中廣泛表達(dá)，其中以肌肉、心臟和肺臟組織表達(dá)豐度最高。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同發(fā)育階段綿羊胚胎腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)具有明顯的時空選擇性。臍帶組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育其表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢；腎臟組織miR-483-5p則是隨著胚胎發(fā)育在第85 d其表達(dá)量下降到最低，其后在115和135 d其表達(dá)量又逐漸上升。不同發(fā)育階段胚胎腎臟、臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)?！窘Y(jié)論】miR-483-5p在綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟或臍帶組織中表達(dá)明顯不同，表明其表達(dá)具有選擇性；依據(jù)miR-483-5p表達(dá)的差異性及其涉及的生物學(xué)功能，推測miR-483-5p在綿羊臍帶和腎臟組織中具有一定的調(diào)控作用。研究為進(jìn)一步了解miR-483-5p在胚胎腎臟和臍帶發(fā)育中的作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

綿羊；胚胎；miR-483-5p；表達(dá)分析

0　引 言

【研究意義】MicroRNA (miRNA，亦稱微RNA) 是一類長約22個核苷酸的小分子非編碼RNA。miRNA主要通過與靶基因mRNA的特定位點結(jié)合，抑制該蛋白的合成或誘導(dǎo)mRNA的降解，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控[1,2]。miRNA在各種生物中普遍存在，據(jù)統(tǒng)計大約有30%左右的功能基因表達(dá)受控于miRNA。這些miRNA只在特定的組織表達(dá)[3]。自1993年Lee等[4]在線蟲中發(fā)現(xiàn)第一條miRNA lin-4以來，研究人員陸續(xù)從動物的線蟲、果蠅(Drosophila)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)以及植物的擬南芥等生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了超過3 000多種miRNA[1,5,6,7]。這些miRNA的功能不但涉及調(diào)控胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝、細(xì)胞分化等方面，還與動物生殖，如卵巢生物學(xué)過程[8,9]、乳腺[10]、睪丸[11]、肌肉[12]等方面息息相關(guān)。miRNAs在動物胚胎發(fā)育中可能起到作用有：在不同發(fā)育周期的空間和時間上調(diào)控某些基因的表達(dá)；參與調(diào)控雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生過程，尤其是生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過程；參與胚胎的背腹模式、前后模式、四肢、神經(jīng)系統(tǒng)的形成等?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNA 483-5p是一類具有重要功能的miRNA。已有研究表明，miR-483-5p調(diào)控胰島素樣生長因子2 (亦稱生長調(diào)節(jié)素A) (insulin-like growth factor,IGF2)[13]，IGF2是一種內(nèi)源性印記基因，其在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中起著非常重要的作用。IGF2基因的表達(dá)產(chǎn)物IGF2是由前體物質(zhì)通過蛋白質(zhì)水解、加工而形成的單鏈蛋白質(zhì)，由67個氨基酸組成，是胚胎性生長因子[14]。Ning等[15]研究表明，給予廣西巴馬小型豬(Guangxi Bama Mini-pig)供體細(xì)胞注射TSA和5-aza-dC能夠?qū)е翴GF2的表達(dá)水平顯著升高，體細(xì)胞與囊胚的DNA甲基化水平顯著降低，囊胚的成活率顯著提高(由16%提高到25.6%)，提示IGF2可能是胚胎正常發(fā)育過程重要的調(diào)控因子。Gong等[16]研究顯示，超大出生并伴隨心臟與肺臟發(fā)育異常的克隆牛(Bostaurus)腎臟組織IGF2的表達(dá)水平極顯著高于正常生理狀態(tài)的克隆牛，進(jìn)一步說明IGF2基因與動物胚胎發(fā)育正常與否密切相關(guān)。Rojas等[17]利用免疫組化技術(shù)對發(fā)育不良性多囊腎病的人(Homosapiens)胎兒腎臟組織IGF2的表達(dá)情況進(jìn)行了跟蹤檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在阻塞性腎臟組織中呈高豐度表達(dá)。在小鼠(Musmusculus)中，miR-483-5p主要結(jié)合在IGF2基因的第二內(nèi)含子區(qū)并調(diào)控此基因的表達(dá)[13]。目前有關(guān)miR-483-5p的研究與報道主要以疾病治療等方面為主，至今未見有關(guān)哺乳動物miR-483-5p介導(dǎo)胚胎發(fā)育機(jī)理方面的報道?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，隨著分子技術(shù)的不斷更新，利用轉(zhuǎn)基因手段進(jìn)行動物分子育種成為國內(nèi)外研究熱點，但不可忽視的是轉(zhuǎn)基因動物胎兒流產(chǎn)率較高，究其實質(zhì)是由胎兒和胎盤異常引起的。臍帶是連接胎兒與母體的重要通道，是胎兒與母體進(jìn)行營養(yǎng)和代謝物質(zhì)的交換中心；腎臟是動物機(jī)體重要的排泄器官，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面扮演著重要的角色。因此從分子水平研究綿羊胚胎臍帶與腎臟的發(fā)育機(jī)制具有深遠(yuǎn)的科學(xué)實踐意義。【擬解決的關(guān)鍵問題】實驗室前期通過生物信息學(xué)軟件篩選出可能與IGF2發(fā)生互作的miRNA，結(jié)合Ma等[13]的實驗結(jié)果，推測miR-483-5p可能是影響綿羊胚胎發(fā)育的重要候選miRNA。基于此，研究獲得了綿羊miR-483-5p成熟體序列；并對其進(jìn)行組織表達(dá)譜分析，同時檢測胚胎不同發(fā)育階段綿羊臍帶和腎臟組織miR-483-5p的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步了解miR-483-5p在臍帶和腎臟中的具體生物學(xué)功能積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物與樣品采集

選擇秋季(8月)購買年齡相近(3～4歲)、健康的中國美利奴成年母羊(購于新疆兵團(tuán)紫泥泉羊場)15只，在新疆農(nóng)墾科學(xué)院種羊場進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)。待其生理狀況穩(wěn)定后，通過公羊早晚試情并配種，記錄配種時間，B超儀結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定羊只妊娠與否。分別于妊娠45、85、115和135 d時手術(shù)摘取成年母羊妊娠胎兒各3只，迅速采集其心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉以及臍帶等組織樣品，置于液氮中保存，以供備用。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol Reagent試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen公司(美國)；實時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(Faster Start Essential DNA Green Master)、LightCycler 480定量儀購于Roche公司(美國)；組織勻漿器(Precellys 24，法國Bertin公司)、核酸蛋白分析儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成

按照Trizol Reagent試劑盒說明書提取45 d中國美利奴羊胚胎心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、臍帶等組織與胚胎不同發(fā)育階段(85、115及135 d)腎臟與臍帶組織的總RNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，核酸蛋白分析儀檢測其純度和濃度。采用Invitrogen公司的M-MLV第一鏈合成試劑盒制備各樣品cDNA。反應(yīng)體系(20 μL)為：5×第一鏈合成緩沖液 4 μL，0.1M DTT 2 μL，10 mM dNTP混合物1 μL，模板(總RNA) 2 μg，引物 2 pmol，RNaseOUTTM核酸酶抑制劑1 μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U) 1 μL。按照試劑盒操作說明中的程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃ 50 min，75℃ 15 min。得到的cDNA置于-20℃保存，以供備用。

1.2.2引物的設(shè)計和合成

從miRbase (http://www.miRbase.org)數(shù)據(jù)庫中搜索mus-miR-483-5p成熟體序列設(shè)計引物，反轉(zhuǎn)錄引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTCCCTTC-3’；設(shè)計miR-483-5p的實時熒光定量PCR上游引物：5’-ACACTCCAGCTGGGAAGACGGGAGGA AAGA -3’，下游引物為通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC -3’；內(nèi)參基因為5 s，反轉(zhuǎn)錄引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGG-3’，實時熒光定量PCR上游引物：5’- ACACTCCAG CTGGGGAA-3’，下游引物為通用引物(同上)，所有引物均由Invitrogen公司進(jìn)行合成。

1.2.3 綿羊miR-483-5p成熟體序列的克隆

以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25 μL，其中cDNA模板1 μL、10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR循環(huán)體系：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶的大小，并選擇目的條帶進(jìn)行切膠回收送交北京華諾時代科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4miR-483-5p的組織表達(dá)譜

以中國美利奴羊45 d胚胎心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、臍帶cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增。①最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的確定：先以5 s為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，通過灰度值確定指數(shù)擴(kuò)增期的最佳循環(huán)數(shù)；②初始模板濃度的確定：根據(jù)5 s指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物灰度值調(diào)整各組織cDNA初始模板濃度，并與miR- 483-5p指數(shù)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物灰度值進(jìn)行比較；③半定量RT-PCR：PCR反應(yīng)體系25 μL，其中10×TaqBuffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10 min。半定量分析miR-483-5p在不同組織中的相對表達(dá)量。

1.2.5miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達(dá)變化規(guī)律

以中國美利奴羊45、85、115和135 d胚胎的腎臟和臍帶組織cDNA為模板，以5 s為內(nèi)參基因，按照Faster Start Essential DNA Green Master試劑盒操作程序，采用SYBR Green I染料法對miR-483-5p的表達(dá)進(jìn)行實時定量PCR檢測。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Master Mix 10 μL、cDNA模板 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 0.4 μL、ddH2O 8.2 μL，每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對照。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 20 s，共計45個循環(huán)；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)分析：以中國美利奴羊45 d胚胎的腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量為1，以持家基因5 s為參照，Ct法(Qr=2-ΔΔCt)分析中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織miR-483-5p的相對表達(dá)量。

2　結(jié)果與分析

2.1中國美利奴羊miR-483-5p成熟體的擴(kuò)增

以中國美利奴羊腎臟cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得了一條長度為73 bp的序列片段，與預(yù)期大小相一致，將該序列與GenBank中公布的miR-483-5p成熟體序列比對發(fā)現(xiàn)，是實驗所需的目的片段。

2.2 綿羊45 d胚胎不同組織miR-483-5p的組織表達(dá)譜

5 s基因在31和32個循環(huán)時目的條帶亮度基本保持一致，說明擴(kuò)增已進(jìn)入平臺期，其中在30個循環(huán)GAPDH基因以指數(shù)形式擴(kuò)增，因此確定30個循環(huán)為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

以5 s為內(nèi)參基因，利用半定量RT-PCR對中國美利奴羊45 d胚胎的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、肌肉、臍帶組織中miR-483-5p表達(dá)情況進(jìn)行了初步檢測。結(jié)果顯示，5 s在各個組織中呈高豐度表達(dá)，條帶亮度基本一致，可以作為內(nèi)參來定量miR-483-5p基因的表達(dá)。經(jīng)檢測， miR-483-5p在中國美利奴羊45 d胚胎心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、臍帶中均有表達(dá)。其中，miR-483-5p在心臟、肺臟以及肌肉組織中呈高豐度表達(dá)，在肝臟、腎臟和臍帶組織中的表達(dá)量相對較低；心臟、肌肉、肺臟組織miR-483-5p的相對表達(dá)量均極顯著高于肝臟、腎臟和臍帶組織(P<0.01)。圖1

注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下同

Note：The different small letters mean the difference atP<0.05, the different capital letters mean the difference atP<0.01, and the same letters means less obvious difference atP>0.05，the same as below

圖1綿羊45 d胚胎不同組織miR-483-5p的表達(dá)
Fig.1 Analysis of the relative expression of miR-483-5p in different tissues of 45 d sheep embryos

2.3 miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達(dá)變化規(guī)律

為了進(jìn)一步了解miR-483-5p對中國美利奴羊胚胎發(fā)育的影響，研究對中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟與臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)變化情況進(jìn)行了實時熒光定量PCR檢測。研究采用相對定量方法，以5 s為內(nèi)參基因，并定義miR-483-5p基因在45 d胚胎的腎臟和臍帶組織表達(dá)水平為1，以便于對miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量。圖2

2.3.1腎臟組織

miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)量由高到低為：135 d>115 d>45 d>85 d，miR-483-5p在45、115和135 d腎臟的表達(dá)量呈高豐度表達(dá)，在85 d的表達(dá)量相對較低；胚胎不同發(fā)育階段腎臟組織間miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)，45、115和135 d腎臟組織miR-483-5p的表達(dá)量顯著高于85 d (P<0.05)，而45、115和135 d的表達(dá)量無明顯差異(P<0.05)。

2.3.2臍帶組織

臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量則是隨著天數(shù)的增加表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢，其表達(dá)量由高到低為：45 d>85 d>115 d>135 d。不同發(fā)育階段臍帶組織間miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)，45 d臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量顯著高于85、115和135 d (P<0.05)，其他三個發(fā)育階段臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)。

圖 2綿羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中miR-483-5p的表達(dá)Fig 2Analysis of the relative expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues of sheep embryos at different developmental stages

3　討 論

近年來，miRNA已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究熱點。miRNA是一類廣泛存在于生物機(jī)體內(nèi)對基因表達(dá)進(jìn)行微調(diào)的小RNA分子。參與機(jī)體一系列重要的生命進(jìn)程，包括：細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)代謝等，在調(diào)控發(fā)育中扮演著非常重要的角色[18,19]。這種調(diào)控機(jī)制主要通過其與靶基因mRNA的3 UTR區(qū)結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或阻斷mRNA實現(xiàn)的。目前有關(guān)miRNA的定量表達(dá)方法主要有兩種：3′端加接頭和stem-loop(頸環(huán)引物)兩種方法，其中頸環(huán)引物qRT-PCR由于其快速、簡單、準(zhǔn)確性高等特點，被廣泛地應(yīng)用于miRNA的表達(dá)研究[20]。

已有報道m(xù)iR-483-5p靶向定位于基因組常染色體11p15.5IGF2基因第二內(nèi)含子內(nèi)[13]，了解IGF2基因的功能有助于對miR-483-5p功能的研究，IGF2基因除了參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長、腫瘤細(xì)胞的增值、肌纖維的分化，還參與大腦的發(fā)育、神經(jīng)的旁分泌和自分泌，此外，IGF2基因是與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的重要調(diào)控因子[17,21]。另有研究表明，miR-483-5p能夠與MeCP2，F(xiàn)IS1，TGF-β等不同靶標(biāo)基因結(jié)合參與血管形成、炎癥反應(yīng)以及等多種生物學(xué)過程[9,13,22,23]。迄今為止，有關(guān)miR-483-5p在動物胚胎發(fā)育中的研究尚未見到有研究報道，為了解miR-483-5p在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段及不同組織中的表達(dá)情況，試驗進(jìn)行了初步研究。

研究首次克隆了綿羊miR-483-5p的成熟序列并對其組織表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，miR-483-5p在所檢測的45 d綿羊胚胎心臟、肝臟、肺臟、腎臟、臍帶以及肌肉組織中均有表達(dá)，其中在心臟、肝臟和肌肉組織中的表達(dá)豐度最高，腎臟和臍帶組織表達(dá)相對較低。Ward 等[25]、Shi等[26]、Li等[24]、Song等[27]、Han等[22]研究表明，miR-483-5p在人的心臟、卵巢、肝臟、肺臟、海馬、腎臟等組織中均有表達(dá)，與研究結(jié)果相近。與在心臟、肝臟和肌肉組織中高表達(dá)相反，miR-483-5p在腎臟和臍帶組織中表達(dá)較低，造成這種原因可能是由于miR-483-5p在45 d胚胎腎臟和臍帶發(fā)揮調(diào)控功能導(dǎo)致，具體功能機(jī)制還需進(jìn)一步的實驗論證。

為了進(jìn)一步了解miR-483-5p對綿羊胚胎發(fā)育的影響，研究重點針對中國美利奴羊不同發(fā)育階段胚胎腎臟和臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)情況進(jìn)行了實時定量PCR檢測。結(jié)果表明，腎臟組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育在第85 d其表達(dá)量下降到最低，其后在115 d和135 d其表達(dá)量又逐漸上升。不同發(fā)育階段胚胎腎臟組織miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)。Liu等[28]研究表明，miR-483-5p存在于IGF2的內(nèi)含子區(qū)，并能夠與IGF2的5′非翻譯區(qū)結(jié)合以正調(diào)控的方式增強(qiáng)胎兒期(成年期不能增強(qiáng)IGF2的轉(zhuǎn)錄)其的轉(zhuǎn)錄；Hale等[29]研究顯示，缺失P2啟動子的成年轉(zhuǎn)IGF2基因小鼠，會導(dǎo)致其體內(nèi)的IGF2量顯著降低，繼而引發(fā)IGF信號通路減弱，最終導(dǎo)致腎小體發(fā)生病變；范秀軍等[30]認(rèn)為小尾寒羊(Small tailed han sheep)120 d左右胚胎腎小體發(fā)育成熟，結(jié)合實驗的研究結(jié)果，研究推斷，miR-483-5p在綿羊胚胎發(fā)育后期可能通過調(diào)節(jié)IGF2基因的轉(zhuǎn)錄參與了胚胎期腎臟組織的正常發(fā)育。同時研究還發(fā)現(xiàn)，臍帶組織miR-483-5p隨著胚胎發(fā)育其表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢，這種表達(dá)差異是否與臍帶形成初期發(fā)育相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。另外，由于此次采樣僅僅選取了4個胚胎發(fā)育階段，未對其他發(fā)育階段腎臟和臍帶樣品組織進(jìn)行檢測分析，miR-483-5p確切的生物學(xué)功能尚需進(jìn)一步的實驗佐證。

4　結(jié) 論

研究獲得了綿羊miR-483-5p的成熟體序列，并利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了其在中國美利奴羊胚胎不同發(fā)育階段腎臟和臍帶組織中的表達(dá)變化規(guī)律。miR-483-5p在45、115和135 d腎臟的表達(dá)量呈高豐度表達(dá)，在85 d的表達(dá)量相對較低；胚胎不同發(fā)育階段腎臟組織間miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)；而在臍帶組織miR-483-5p的表達(dá)量則是隨著天數(shù)的增加表達(dá)量呈逐漸下降的趨勢，不同發(fā)育階段臍帶組織間miR-483-5p的表達(dá)量呈顯著性差異(P<0.05)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究該miRNA在綿羊胚胎臍帶和腎臟發(fā)育中的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Analysis of the Relative Expression of MicroRNA-483-5p during Different Developmental Stages and Various Tissues of Sheep Embryo

ZHANG Yi-yuan, TANG Hong, GUO Yan-hua, WANG Xin-hua, WANG Li-min, ZHOU Ping

(ResearchInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences/KeyLaboratoryofOvineBreedingBiologyTechnologyofXinjiangProductionandConstructionCorps,ShiheziXinjiang832000，China)

【Objective】 The aim of this study is to detect the expression of MicroRNA (miR) 483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos in Chinese Merino and to explore the roles of miR-483-5p in embryonic development. 【Method】In this study, different development periods (45 d, 85 d, 115 d and 135 d 4 times) kidney and umbilical cord tissue of Chinese Merino sheep embryo were taken as the research material, the expression of miR-483-5p in different tissues of 45th day embryos of sheep was analyzed by RT-PCR. On the basis, the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages of embryos were analyzed and compared by Real-time PCR.【Result】The results showed that miR-483-5p were widely expressed in the tested tissues, in which the expression level of muscle, heart and lung was much higher than the others. The real-time PCR showed that the expression of miR-483-5p in kidney and umbilical cord tissues at different stages embryos of sheep had obvious temporal selectivity. In the wake of embryo development the expression of miR-483-5p in umbilical cord tissues was gradually decreased, but in kidney tissues, the expression of miRNA 483-5p was declined to the lowest in 85 d of embryonic development, then gradually increased in the 115 d and 135 d. There were significant differences for expression change extent of miR-483-5p in kidney or umbilical cord in different development stages of embryo.【Conclusion】These results suggested that the expression of miR-483-5p in kidney or umbilical cord at different development stages and various tissues of embryos were obviously different, which suggested that miRNA 483-5p was selectively expressed in sheep embryonic development. It was deduced that miR-483-5p had regulation function in kidney and umbilical cord according to the difference of expression and the reported function of miR-483-5p. These results might provide the theoretical basis for further study of mechanism of microRNAs in kidney and umbilical cord of sheep embryo.

sheep; embryo; miR- 483-5p; expression analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.025

2015-11-12

國家自然科學(xué)基金項目(31160227)；兵團(tuán)院士資金專項(2015AG018)；新疆農(nóng)墾科學(xué)院青年科學(xué)基金(YQJ201502)

張譯元(1988-)，女，山東單縣人，助理研究員，研究方向為動物體細(xì)胞克隆，(E-mail)zhangyiyuan1988@sina.com

王立民(1980-)，男，內(nèi)蒙古包頭人，副研究員，研究方向為綿羊體細(xì)胞克隆與胚胎發(fā)育，(E-mail)wanglm1980@126.com

S827.1

A

1001-4330(2016)04-0778-07