孫歡歡，韓兆雪，譚登峰，張小燕

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

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新培育玉米自交系苗期生理生化指標(biāo)與其抗旱性綜合評價

孫歡歡1，韓兆雪2，譚登峰1，張小燕1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100)

以73份新培育的玉米自交系和7份已知玉米抗旱自交系為材料，采用培養(yǎng)間自然干旱脅迫處理方法，研究相關(guān)生理生化指標(biāo)與玉米抗旱性的關(guān)系。通過玉米葉片失水率(WLR)和相對含水量(RWC)的測定分析，篩選出15份自交系進行脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量以及超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性共5項生理生化指標(biāo)的測定，對5項指標(biāo)的耐旱系數(shù)分級，對玉米自交系的抗旱性進行綜合評價。結(jié)果表明，干旱脅迫下大多數(shù)自交系表現(xiàn)出相對含水量下降趨勢，失水率、脯氨酸含量、丙二醛含量和三個抗氧化酶類活性均表現(xiàn)出升高趨勢。篩選出高抗旱自交系4份，抗旱自交系3份，中抗旱自交系2份，敏感自交系3份，高敏自交系3份。

玉米；自交系；抗旱性；指標(biāo)

干旱是影響玉米產(chǎn)量的主要因素，玉米是對水分敏感的作物之一[1]。我國干旱半干旱耕地約占全國總耕地面積的51%[2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同玉米種質(zhì)的抗旱性存在明顯差異[3]?？购涤衩灼贩N的選育、推廣和種植是控制因干旱導(dǎo)致的玉米減產(chǎn)的重要手段[4]。

水分缺乏會引起植物形態(tài)、生理及生化上相應(yīng)的變化[5]，苗期干旱會導(dǎo)致玉米幼苗生長受阻，進而引起減產(chǎn)。植株對干旱的綜合反應(yīng)體現(xiàn)在生長受到抑制，其主要是由體內(nèi)各種生理代謝反應(yīng)所決定的[6-10]，生理生化特性形成了一系列抵御干旱脅迫的機制[11]。因此，對其中典型生理指標(biāo)的研究有助于對抗旱性的深入了解，以及抗旱種質(zhì)的選育。

本研究以7份已知玉米抗旱自交系和本課題組新培育的73份玉米自交系為試驗材料，采用失水率和相對含水量兩個指標(biāo)進行玉米抗旱自交系的初篩，篩選出葉片失水率低、相對含水量高的玉米自交系12份和失水率高、相對含水量低的材料3份，進一步通過對正常和干旱條件下玉米脯氨酸、丙二醛和抗氧化酶活性等生理生化指標(biāo)的測定，對玉米自交系進行抗旱性綜合評價，為抗旱玉米自交系的選育提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

80份玉米自交系，其中73份玉米材料為本課題組新培育的玉米自交系，7份已知抗旱性的材料來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院(ZM74-ZM80)(表1)。

表1　玉米自交系及編號

1.2材料培養(yǎng)和干旱脅迫處理

所選玉米自交系材料培養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院組織培養(yǎng)間，培養(yǎng)間溫度28/26℃(白天/晚上)，16/8h光照。供試材料種植于盛有蛭石的小圓盆中(高8 cm×半徑3.5 cm，每個自交系至少20株，每盆4株，置于黑色方盤中(40×20×15 cm)，正常澆水，幼苗長至一葉一心期開始澆灌1/2 Hoagland營養(yǎng)液保持幼苗長勢良好。待幼苗長至三葉一心期時，每個自交系選取整齊一致的三盆幼苗，濾紙上進行空氣干旱處理12 h(失水率和相對含水量兩個指標(biāo)的測定是選取兩葉一心期幼苗進行處理)。

1.3生理生化指標(biāo)測定

1.3.1失水率測定將待處理材料每盆各選取一株，剪取第二片葉，立即稱量樣品鮮重，將葉片置于鋪有干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，于22℃，相對濕度70±5%的溫室放置，24 h后，稱取失水后的質(zhì)量，然后繼續(xù)置于70℃烘箱中處理24 h，稱取干重。失水率計算公式如下：WLR(%)=(FW-W24)/(DW·24)×100%(FW：樣品的鮮重，W24：離體葉片24 h失水重，DW：樣品干重)。方法參照《植物生理學(xué)實驗》[12]。

1.3.2相對含水量測定兩葉一心期玉米幼苗被分為兩組：對照組正常澆水避免干旱，干旱處理組濾紙干旱處理12 h。剪取對照和處理幼苗的第二片葉，立即稱量樣品的鮮重，隨后將其漂浮于盛滿蒸餾水的三角瓶中，放置于4℃冰箱中24 h后取出，用濾紙吸去葉片表面的水滴后，立即稱取葉片的吸脹重。將葉片置于干燥濾紙的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)置于70℃的烘箱24 h后，稱取干重。

相對含水量按如下公式計算：RWC(%)=[(FW-DW)/(TW-DW)]×100%(FW：樣品的鮮重，TW：葉片24 h吸水重，DW：樣品干重)。方法參照《植物生理學(xué)實驗》[12]。

1.3.3脯氨酸、丙二醛和三種抗氧化酶活性測定選擇失水率和相對含水量差異大的15份玉米自交系材料進一步進行脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)及三種抗氧化酶活性測定。同一植株的第二片葉和第三片葉分別用于脯氨酸和丙二醛含量測定；同一植株的第二片和第三片葉混合用于三種酶類SOD、CAT和POD的提取和分別測定，每個指標(biāo)均進行三個生物學(xué)重復(fù)測定。

采用茚三酮法測定離體葉片游離脯氨酸的含量；采用硫代巴比妥酸法測定離體葉片丙二醛含量，具體方法參考《植物生理學(xué)研究技術(shù)》[13]； SOD活性、CAT活性、POD活性按Donahue，Okapodu和Aebi等方法測定[14-16]。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與作圖分析使用Excel軟件；統(tǒng)計分析使用SPSS軟件。

脯氨酸含量、SOD活性、CAT活性和POD活性的耐旱系數(shù)計算公式如下[17]：

耐旱系數(shù)=(干旱測定值-對照測定值)/對照測定值

MDA含量的耐旱系數(shù)計算公式如下：

耐旱系數(shù)=1-(干旱測定值-對照測定值)/對照測定值

2　結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對玉米幼苗WLR和RWC的影響

本研究結(jié)果表明，80份玉米自交系的失水率差異較大，在0.073%～0.357%范圍之間，失水率較低的材料主要有ZM13和ZM41，失水率較高的材料主要有ZM7、ZM14和ZM61。

正常澆水條件下，80份玉米自交系的相對含水量變化幅度不大，在85.473%～98.102%之間，經(jīng)過12 h干早處理后，80份玉米材料的相對含水量均明顯下降，下降程度較低的主要有ZM41、ZM77和ZM79等。此外，有些失水率較低的玉米自交系在干旱處理后相對含水量下降幅度也較小，如ZM13、ZM41和ZM49。

根據(jù)失水率和相對含水量的測定結(jié)果，初步篩選出失水率低相對含水量高的材料12份(ZM11、ZM13、ZM21、ZM25、ZM41、ZM49、ZM52、ZM75、ZM76、ZM77、ZM78、ZM79)、失水率高相對含水量低的材料3份(ZM7、ZM14、ZM61)，再次進行WLR和RWC的3個生物學(xué)重復(fù)測定，結(jié)果表明，與最初的WLR和RWC測定結(jié)果基本吻合(圖1和圖2)，由此說明WLR與RWC是抗旱性初步篩選的可靠指標(biāo)。將篩選出來的15份自交系材料進一步進行脯氨酸、丙二醛、SOD、CAT和POD指標(biāo)的測定分析。

圖1　干旱脅迫對15份玉米自交系材料失水率的影響

圖2干旱脅迫對15份玉米自交系材料相對含水量的影響

Fig.2Effects of drought stress on RWC of 15 inbred lines

2.2各指標(biāo)的方差分析

通過對15個玉米自交系進行干旱脅迫處理，測定3個生物學(xué)重復(fù)的5個生理及生化指標(biāo)，對測定結(jié)果進行方差分析。從表2可以看出，5個指標(biāo)在品種間和處理間的差異都達到了極顯著水平，表明不同玉米自交系的抗旱性不同，且玉米對干旱脅迫處理比較敏感。5個指標(biāo)在品種與處理間的交互作用中除MDA含量為顯著水平，其余4個指標(biāo)均達到極顯著水平，說明在干旱處理下不同自交系呈現(xiàn)出不同程度的抗旱性。即在干旱脅迫下，不同玉米自交系的5個指標(biāo)的測定結(jié)果主要取決于自交系、干旱脅迫及其互作。

表2　5個指標(biāo)品種間與不同處理的方差分析

注： **表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.3干旱脅迫對Pro和MDA含量的影響

與對照組相比，干旱脅迫下15份玉米自交系的Pro含量均明顯上升，其中ZM11和ZM77Pro含量升高明顯(圖3)。

圖3干旱脅迫對Pro含量的影響

Fig.3Effects of drought stressed on Proline content

干旱處理后15份自交系材料MDA含量呈現(xiàn)不同程度上升。除ZM25外，其余14個自交系MDA含量升高倍數(shù)均小于2，其中自交系ZM61和ZM7MDA含量約為對照組的1.01倍，表明這兩份材料受干旱脅迫影響較小(圖4)。

圖4干旱脅迫對MDA含量的影響

Fig.4Effects of drought stress on MDA

2.4干旱脅迫對三種抗氧化酶活性的影響

圖5～圖7顯示，與對照組相比，干旱脅迫下15份玉米自交系三種抗氧化酶活性均呈現(xiàn)不同程度的上升，其中ZM25和ZM76在干旱處理后SOD、CAT和POD活性上升水平高，ZM13、ZM7、ZM75和ZM79中抗氧化酶活性上升水平低。干旱處理后，SOD活性上升超過對照組3倍的自交系有ZM25和ZM76；CAT活性上升超過對照組3倍的自交系有ZM11、ZM25、ZM52和ZM76；POD活性上升超過對照組3倍的自交系有ZM14。

圖5　干旱脅迫對SOD活性的影響

圖6　干旱脅迫對CAT活性的影響

圖7干旱脅迫對POD活性的影響

Fig.7Effects of drought stress on POD

2.5耐旱系數(shù)及抗旱性綜合評價

耐旱系數(shù)可用于評價作物抗旱性，在一定程度上反映了作物的抗旱水平。對15個自交系的生理指標(biāo)測定結(jié)果進行耐旱系數(shù)分析，結(jié)果表明，各自交系間、各生理指標(biāo)耐旱系數(shù)不同，但不同生理指標(biāo)的耐旱系數(shù)水平基本相當(dāng)(表3)，而同一自交系不同指標(biāo)的耐旱系數(shù)或同一指標(biāo)不同自交系的耐旱系數(shù)均有較大變幅，用單項指標(biāo)的耐旱系數(shù)來評價玉米自交系的抗旱性具有片面性，不能準(zhǔn)確評價各自交系的抗旱性[18]。因此，為從總體上準(zhǔn)確把握玉米的抗旱性，避免從單一指標(biāo)上片面地判斷玉米抗旱性，將每個指標(biāo)下15個自交系的耐旱系數(shù)分為五級，再將同一自交系所有指標(biāo)的分級數(shù)累加得到其抗旱性的總評價結(jié)果，即為該自交系的分級結(jié)果，最終將所有自交系的分級結(jié)果進行統(tǒng)一觀察比較。結(jié)果表明，本研究中15份自交系材料的抗旱性可以分為5級，即高抗、抗、中抗、敏感和高感(表4)，據(jù)此篩選出高抗旱自交系4份，抗旱自交系3份，中抗旱自交系2份，干旱敏感自交系3份，干旱高敏感自交系3份。其中ZM76、ZM11、ZM25、ZM77為高抗旱自交系，ZM14、ZM21、ZM75為高敏感自交系。

3　討　論

根據(jù)生理生化指標(biāo)對玉米自交系的抗旱性進行綜合評價，以若干個可靠指標(biāo)結(jié)合科學(xué)的統(tǒng)計分析考察材料抗旱性的評價方法，適用于植物自交系抗旱鑒定[7]。本研究采用自交系抗旱性分級方法，將各個指標(biāo)綜合聯(lián)系起來，避免單一指標(biāo)評價產(chǎn)生的片面性，15個自交系5個生理生化指標(biāo)下的分級結(jié)果顯示出明顯的差異。

表3　玉米自交系生理生化指標(biāo)的耐旱系數(shù)分析

表4　玉米自交系苗期抗旱性綜合評價

許多研究表明WLR、RWC、Pro含量、MDA含量、SOD、CAT及POD活性是玉米苗期抗旱性鑒定的可靠指標(biāo)[19-21]。其中，RWC與所受干旱脅迫呈負(fù)相關(guān)，WLR、MDA含量與干旱脅迫呈正相關(guān)，它們的變化幅度越小抗旱性越強；Pro含量、SOD、CAT、POD活性與干旱脅迫呈正相關(guān)，且一定范圍內(nèi)變化幅度越大抗旱性越強[7]。本研究結(jié)果也說明了各生理生化指標(biāo)與自交系所受干旱脅迫的相關(guān)性是吻合的。

SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，爾后過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)會立即將其分解為完全無害的水，三種酶組成了一個完整的防氧化鏈條。而丙二醛(MDA)是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，推測干旱處理下MDA含量的相對變化程度，可能與SOD、CAT、POD三種酶活性存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。但本研究結(jié)果表明，在實驗室條件下自交系MDA含量指標(biāo)與SOD、CAT、POD活性指標(biāo)較吻合的只有ZM76和ZM79，吻合程度較低。其原因可能來自不同自交系的膜透性；脯氨酸作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，推測其與WLR可能存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，本研究中并未能體現(xiàn)兩者明顯的吻合度，其原因可能是不同自交系苗期材料的氣孔開度存在差異。結(jié)合15個自交系苗期抗旱性的綜合評價結(jié)果與它們失水率和相對含水量結(jié)果比較，表明在ZM76、ZM11、ZM25、ZM77、ZM52、ZM78、ZM49和ZM14自交系中這些結(jié)果較吻合。

綜上所述，采用分級方法對自交系抗旱性進行綜合評價，結(jié)果表明玉米自交系間的抗旱性存在明顯差異。該方法中篩選得到的高抗旱自交系ZM76、ZM11、ZM25、ZM77在干旱地區(qū)具有一定推廣價值，其中ZM76與ZM77為已知的玉米抗旱自交系，ZM11和ZM25為本課題組新培育的玉米自交系。

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Comprehensive evaluation of physiological and biochemical indexes and drought resistance of new maize inbred lines during seedling stage

SUN Huan-huan1, HAN Zhao-xue2, TAN Deng-feng1, ZHANG Xiao-yan1

(1.College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China;2.ColegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Seventy-three new maize inbred lines cultivated by our research group and seven known lines were cultivated under simulated drought-stress condition in greenhouse to investigate the relationships between drought tolerance related physiological and resistance and drought. Through testing and analyzing their WLR and RWC, 15 inbred lines were selected. Five physiological and biochemical indexes of these inbred lines were examined including proline content, malondialdehyde (MDA) content, SOD activity, CAT activity, and POD activity. Based on the classification of five physiological and biochemical indexes, drought tolerance of the inbred lines was evaluated. The results indicated that WLR, proline content, MDA content, SOD activity, CAT activity and POD activity were increased, but relative water content became decreased. The comprehensive evaluation on drought tolerance of these lines classified them into high drought tolerance (four lines), drought tolerance (three lines), medium drought tolerance (two lines), drought susceptibleness (three lines), and high drought susceptibleness (three lines).

maize; inbred line; drought tolerance; index

1000-7601(2016)05-0009-06

10.7606/j.issn.1000-7601.2016.05.02

2015-04-10

國家自然科學(xué)基金(31201268)；陜西省自然科學(xué)基金(2011JQ3005)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(QN2011114和2452015412)

孫歡歡(1992—)，女，碩士研究生，主要從事玉米抗旱研究。 E-mail:sunhuanhuan000@gmail.com。

張小燕，教授，主要從事品種資源與品種生態(tài)研究。 E-mail: zhangxiang8504@126.com。

S332.1

A