胡能兵，隋益虎，林　毅

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230031)

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紫色辣椒葉片花青素的純化及其生物活性分析

胡能兵1，隋益虎1，林毅2

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230031)

大孔樹(shù)脂；紫色辣椒；抗氧化；生物活性

花色苷具有清除自由基的功效，主要通過(guò)提供氫原子與自由基作用，終止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的傳遞，進(jìn)而干擾新自由基的增殖，但原料來(lái)源和加工工藝的不同會(huì)導(dǎo)致其清除自由基的能力有所差異。發(fā)酵法提取的紫甘薯色素PSPPs2比常規(guī)法提取的PSPPs1和BHT高，尤其是在低濃度(0.2 mg·mL-1)時(shí)，其清除DPPH自由基的能力達(dá)到92.77%[1]。此外，花色苷還具有抑菌能力。楊梅花色苷提取物對(duì)灰霉葡萄孢的抑制能力隨濃度增加而提高，濃度為10%時(shí)，抑菌率達(dá)到29.28%[2]。野生毛葡萄花青素提取物對(duì)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度升高和作用時(shí)間的增加，抑菌率升高；但對(duì)真菌抑菌效果不明顯，尤其是對(duì)煙曲霉無(wú)作用[3]。

紫色辣椒(Capsicum annuum L)是稀有的辣椒種質(zhì)資源[4]。本試驗(yàn)擬以提取、濃縮后的紫色辣椒7036的葉片花青素為材料，研究其純化工藝及影響因素，并對(duì)其精制品進(jìn)行抗氧化和抑菌功能研究，探明其抗氧化和抑菌特性，為其在食品、藥品以及化妝品行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

紫色辣椒7036系安徽科技學(xué)院辣椒課題組提供。在辣椒營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，取其濃紫色葉片，經(jīng)液氮研磨，提取葉片花青素，濃縮，用于后續(xù)的大孔樹(shù)脂純化及凍干，之后獲得葉片花青素精制品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大孔樹(shù)脂吸附葉片花青素的正交設(shè)計(jì)

前期預(yù)備試驗(yàn)表明，HPD-100是最適宜紫色辣椒葉片花青素吸附的大孔樹(shù)脂。設(shè)置pH(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)、溫度、固液比(固體為樹(shù)脂質(zhì)量，液體為10 mL濃縮液與40 mL pH緩沖液的混合液)、轉(zhuǎn)速為考查因子，因素水平設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[5-7]并略作調(diào)整，按L16(45)正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以吸附前后溶液的吸光度(542 nm)差值為指標(biāo)(表1)。每處理重復(fù)3次，運(yùn)用DPS軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行極差、方差分析。

表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 1Orthogonal test design

水平A∶pHB:溫度/℃C:固液比D:轉(zhuǎn)速(r·min-1)13201∶5010024302∶5015035403∶5020046504∶50250

1.2.2葉片花青素解吸附

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)吸附紫色辣椒葉片花青素的樹(shù)脂各2 g，分別加入0，20%，40%，60%，80%，100%的乙醇溶液50 mL，置于搖床中震蕩1 h，測(cè)定各溶液的吸光度。

1.2.3葉片花青素精制品制備

將解吸附后的液體經(jīng)過(guò)減壓、真空濃縮及濃縮液凍干后，獲得粉末狀精制品，精制品保存于-20℃條件下，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4抗氧化性能測(cè)定

1.2.5抑菌性能測(cè)定

精制品溶液的制備：將粉末狀的紫色辣椒葉片色素精制品用25%的乙醇分別稀釋至10，5，2.5，1.25 mg·mL-1，分別經(jīng)過(guò)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，保存待用。

培養(yǎng)基平板制備：大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板，根霉和黑曲霉用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基平板。用無(wú)菌水將上述各菌的孢子配制成106～107的懸液，無(wú)菌吸取0.2 mL的各菌液涂布至上述平板上。

抑菌試驗(yàn)：采用濾紙片和牛津杯法。濾紙片法：取直徑為1 mm的濾紙片，滅菌后浸于過(guò)濾除菌含不同濃度的紫色辣椒葉片花青素精制品的液體中1 min，分別鋪在接種有大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌等細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)基上。牛津杯法：將滅菌后的外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm的牛津杯置于平板表面，吸取上述濃度的紫色辣椒葉片花青素精制品溶液0.2 mL至牛津杯中，盡量不要將菌液溢出牛津杯外。用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1各因素對(duì)大孔樹(shù)脂吸附紫色辣椒葉片花青素的影響

由表2的極差分析結(jié)果可知，影響大孔樹(shù)脂HPD-100吸附紫色辣椒葉片花青素的各因素依次為：A(pH)>C(固液比)>B(溫度)>D(轉(zhuǎn)速)。從各因素來(lái)看，理論上達(dá)到最大的組合應(yīng)為A4B3C2D2。方差分析結(jié)果顯示，在不同pH、溫度、固液比和轉(zhuǎn)速條件下，以HPD-100為樹(shù)脂開(kāi)展純化，pH、溫度和固液比的不同水平間差異達(dá)到極顯著水平，而轉(zhuǎn)速各水平間無(wú)顯著差異。從表2可以看出，在所試驗(yàn)的各排列組合中，最優(yōu)組合為A4B3C2D4。考慮到理論最優(yōu)組合與試驗(yàn)最優(yōu)組合僅有轉(zhuǎn)速上的差異，而轉(zhuǎn)速對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響，因此，用HPD-100樹(shù)脂吸附紫色辣椒葉片花青素的最優(yōu)組合為A4B3C2D4。

表2HPD-100大孔樹(shù)脂吸附紫色辣椒葉片花青素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 2Result of orthogonal design of purification of anthocyanin from purple pepper leaf by HPD-100

編號(hào)ABCD吸光度差值111110.957212221.070313331.067414441.085521231.143622141.042723411.192824321.198931341.2081032431.2091133121.2071234211.3101341421.2591442311.2401543241.3311644131.173K14.1794.5674.3794.699 K24.5754.5614.8544.734K34.9344.7974.7134.592K45.0034.7664.7454.666k11.0451.1421.0951.175 k21.1441.1401.2141.184k31.2341.1991.1781.148k41.2511.1921.1861.167極差R0.2060.0590.1190.036

2.2紫色辣椒葉片花青素的解吸附

乙醇溶液濃度的差異，會(huì)導(dǎo)致其極性有所不同，進(jìn)而影響葉片花青素與大孔樹(shù)脂的分子間作用力；此外，不同乙醇濃度也會(huì)影響葉片花青素在乙醇中的溶解度。本試驗(yàn)選擇了0，20%，40%，60%，80%和100%等6種不同濃度的乙醇，分別對(duì)濕重為2 g、充分吸附紫色辣椒葉片花青素的樹(shù)脂進(jìn)行解吸附(圖1)。當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，樹(shù)脂解吸附后溶液的最大吸光度為1.248；當(dāng)乙醇濃度在0～80%之間時(shí)，隨著乙醇濃度的上升，吸光度呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在40%乙醇條件下，解吸附樹(shù)脂HPD-100后溶液的吸光度最大，為0.774。由于乙醇濃度過(guò)高會(huì)不利于凍干和粉狀精制品的獲得，故選擇40%的乙醇作為解吸附最適乙醇濃度。

2.3紫色辣椒葉片花青素抗氧化性能

2.4紫色辣椒葉片花青素抑菌性能

采用濾紙法分別比較了紫色辣椒葉片花青素精制品對(duì)4種細(xì)菌和2種真菌的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)紫色辣椒葉片花青素精制品濃度為5 mg·mL-1時(shí)，對(duì)真菌(根霉、黑曲霉)和細(xì)菌都沒(méi)有抑菌效果。在高濃度條件下，即當(dāng)精制品濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌有一定的抑菌效果，通過(guò)抑菌圈直徑可知，其對(duì)上述細(xì)菌的抑菌效果依次為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>地衣芽孢桿菌。

運(yùn)用牛津杯法比較了紫色辣椒葉片花青素精制品對(duì)4種細(xì)菌和2種真菌的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)紫色辣椒葉片花青素精制品濃度為5 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和地衣芽孢桿菌就表現(xiàn)出了抑菌作用，但對(duì)真菌(根霉、黑曲霉)沒(méi)有抑菌效果。由抑菌圈直徑可知，其對(duì)上述細(xì)菌的抑菌效果依次為：大腸桿菌>金黃色葡萄球菌=地衣芽孢桿菌。當(dāng)紫色辣椒葉片花青素精制品濃度提高到10 mg·mL-1時(shí)，其抑菌效果與5 mg·mL-1時(shí)略有不同，對(duì)4種細(xì)菌均表現(xiàn)出明顯的抑菌作用。由抑菌圈直徑可知，高濃度花青素精制品對(duì)4種細(xì)菌的抑菌效果依次為：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>地衣芽孢桿菌>蘇云金芽孢桿菌。

圖1　乙醇濃度對(duì)HPD-100樹(shù)脂解吸附的影響Fig.1　Influence of ethanol concentration on desorption of HPD-100

圖2　紫色辣椒葉片色素精制品對(duì)羥自由基(·OH)、超氧陰離子·)及DPPH的清除效果Fig.2　Elimination effect of purple pepper leaf anthocyanin on ·OH(A)，superoxide anion(B) and DPPH(C)

表3紫色辣椒葉片花青素精制品對(duì)菌種的抑制作用(mm)

Table 3Antimicrobial effect of different concentrations of purple pepper leaf anthocyanin (mm)

試驗(yàn)方法濃度/(mg·mL-1)大腸桿菌金黃色葡萄球菌地衣芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌根霉黑曲霉濾紙法5——————108.377.637.20———牛津杯法511.010.510.5———1016.517.514.512.5——

3　討論

關(guān)于花色苷、花青素的抗氧化性能，目前已有較多報(bào)道，其在減緩或治療心血管疾病、血液循環(huán)障礙等方面具有實(shí)際意義。然而，國(guó)內(nèi)關(guān)于花青素等物質(zhì)在抑菌方面的報(bào)道較少，僅限于紫甘薯、山楂、葡萄籽等少量植物[9-17]。甘薯是花青素的主要來(lái)源，王關(guān)林等[15]以甘薯塊根花青素(SPAC)為原料，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌都有不同程度的抑制作用，尤以金黃色葡萄球菌對(duì)SPAC的敏感性最強(qiáng)。其機(jī)理可能為：花青素的分子結(jié)構(gòu)含有較多的酚羥基，可與蛋白質(zhì)或酶通過(guò)氫鍵結(jié)合，引起菌體嚴(yán)重的質(zhì)壁分離、細(xì)胞質(zhì)固縮，并解體成空泡，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

此前，尚未有紫色辣椒葉片花青素精制品制備及其生物活性的研究報(bào)道。本試驗(yàn)研究表明，紫色辣椒葉片可作為花青素的新來(lái)源，影響大孔樹(shù)脂HPD-100吸附紫色辣椒葉片花青素的因素大小順序?yàn)椋篈(pH)>C(固液比)>B(溫度)>D(轉(zhuǎn)速)，40%乙醇可作為解吸附的最適乙醇濃度。對(duì)花青素精制品的分析表明，其具有一定的抗氧化能力，尤其是對(duì)羥自由基(·OH)的清除效果要優(yōu)于Vc。考慮到本試驗(yàn)中所采用的花青素精制品在制備過(guò)程中涉及諸多的高溫環(huán)節(jié)，對(duì)花青素有一定的破壞作用，可能導(dǎo)致花青素含量的損失，影響花青素的抗氧化性能，因此，運(yùn)用新技術(shù)減少高溫環(huán)節(jié)或縮短高溫處理時(shí)間，有望極大提升紫色辣椒葉片花青素的商品價(jià)值。

食品工業(yè)中，以細(xì)菌、霉菌和酵母菌等為代表的微生物常常會(huì)導(dǎo)致食品敗壞，而化學(xué)防腐劑大都具有一定的毒性，長(zhǎng)期或過(guò)量使用會(huì)極大損害人體的健康。將天然產(chǎn)物，如花色苷等用于食品保存，或?qū)⑻烊划a(chǎn)物與現(xiàn)有防腐劑復(fù)配，既可減少防腐劑的用量，又會(huì)賦予食品特有的營(yíng)養(yǎng)保健功能，具有很高的開(kāi)發(fā)潛能。本研究的抗菌試驗(yàn)表明，紫色辣椒葉片花青素對(duì)細(xì)菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等都有一定的抑制效果，對(duì)真菌無(wú)抑制作用。而申杰[2]研究認(rèn)為，楊梅花色苷對(duì)灰霉葡萄孢有抑制效果。這種差異可能與花青素的來(lái)源和類(lèi)型有關(guān)。

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(責(zé)任編輯高峻)

Purification of anthocyanin from purple pepper leaf and its bio-activities

HU Neng-bing1，SUI Yi-hu1，LIN Yi2

(1.College of Agriculture，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China;2.College of Life Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230031，China)

macroporous resin;purple pepper;anti-oxidation;bio-activities

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):452-456http://www.zjnyxb.cn

胡能兵，隋益虎，林毅.紫色辣椒葉片花青素的純化及其生物活性分析 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3)： 452-456.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.15

2015-06-25

安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A057)；國(guó)家星火計(jì)劃(2012GA710028)；安徽科技學(xué)院自然科學(xué)項(xiàng)目(ZRC2013374)

胡能兵(1980—)，男，安徽東至人，博士，副教授，從事園藝植物組織培養(yǎng)及育種工作。E-mail∶hunengbing@126.com

S63

A

1004-1524(2016)03-0452-05