曹 文 博，　鄭 秋 月，　張 公 亮，　侯 紅 漫

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連　116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局， 遼寧 大連　116001 )

?

凍干奶粉樣品中大腸桿菌O157和O111的檢測(cè)方法

曹 文 博1，鄭 秋 月2，張 公 亮1，侯 紅 漫1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連116034；2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局， 遼寧 大連116001 )

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立一種檢測(cè)凍干奶粉樣品中大腸桿菌的方法。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法將大腸桿菌O157和O111分離純化，根據(jù)大腸桿菌O157和O111的兩對(duì)特異性基因rfbE和wbdl設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)；由于該大腸桿菌可能是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌，對(duì)STEC的特異性毒力基因stx1、stx2b、eae設(shè)計(jì)引物和探針并檢測(cè)。結(jié)果表明,該凍干奶粉樣品中含有大腸桿菌O157和O111，且致病菌O157檢出毒力基因stx1、stx2b、eae，即產(chǎn)志賀毒素與黏附素，致病菌O111檢出毒力基因eae，不產(chǎn)志賀毒素而產(chǎn)黏附素。該方法能準(zhǔn)確分離大腸桿菌O157和O111，利用實(shí)時(shí)熒光PCR的高靈敏度和特異性快速檢驗(yàn)致病菌及其特異性毒力基因。

大腸桿菌O157；大腸桿菌O111；實(shí)時(shí)熒光PCR；凍干奶粉

0　引　言

腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157能產(chǎn)生致死性志賀毒素(Shiga toxin, Stx)，1982年被確認(rèn)為嚴(yán)重致病菌。O157型是STEC中致病力最強(qiáng)、流行趨勢(shì)最廣及發(fā)病率最高的血清型，感染100 CFU O157 STEC就能致病，病患接觸者也能引起繼發(fā)感染，可引起人類腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis, HC)，溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)，甚至死亡[1]。近年來(lái)，非O157型STEC中一些高致病力菌株對(duì)人類的健康也存在嚴(yán)重威脅，多達(dá)200多種的非O157菌株與人類疾病相關(guān)，如O111、O26、O45、O103等[2]。目前世界范圍內(nèi)對(duì)STEC仍缺乏有效的控制手段[3-4]。

對(duì)食源性致病菌大腸桿菌的檢測(cè)未達(dá)到分型，檢測(cè)后對(duì)致病菌的產(chǎn)毒情況缺乏了解，這給公共食品衛(wèi)生和人類生命安全帶來(lái)了極大的威脅。本研究將傳統(tǒng)培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合，利用3M紙片法初步判斷樣品中含有大腸桿菌，經(jīng)分離純化，以特異基因rfbE、wbdl[5]和STEC特異性毒力基因stx1、stx2b、eae作為大腸桿菌O157和O111檢測(cè)的靶基因[6]，應(yīng)用RT-PCR建立一種檢測(cè)凍干奶粉樣品中的大腸桿菌及其毒力因子的方法。

1　材料與方法

1.1材料

NB營(yíng)養(yǎng)肉湯、TSB胰蛋白胨大豆肉湯、EMB瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TSI三糖鐵瓊脂，英國(guó)OXOID 公司；3M PetrifilmTME.coli紙片，美國(guó)3M公司；O157顯色培養(yǎng)基，上海欣中生物工程有限公司；O157、O111診斷血清，丹麥國(guó)家血清研究公司；TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0(Code：DV810A)、引物、Taqman探針，大連寶生物公司。熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.2方法

1.2.1菌種的分離

挑取藍(lán)色帶有氣泡的單菌落進(jìn)行血清鑒定，經(jīng)鑒定后的單菌落劃線接種于EMB、O157顯色培養(yǎng)基，于(36±1) ℃下過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落特征，挑取O157顯色培養(yǎng)基上的單菌落接種于普通肉湯過(guò)夜培養(yǎng)，待提取DNA。

1.2.2細(xì)菌DNA的提取

取4 mL單菌落的肉湯培養(yǎng)基于100 ℃下煮沸15 min滅活，用試劑盒提取細(xì)菌DNA。

1.2.3引物與Taqman探針

根據(jù)大腸桿菌O157和O111的特異性基因rfbE和wbdl，以及STEC的特異性毒力基因stx1、stx2b、eae為靶基因設(shè)計(jì)引物探針，如表1、2所示。

1.2.4熒光PCR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為25 μL，含Premix Ex TaqTM12.5 μL， Rox Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，上下游引物、探針各1 μL，ddH2O 8 μL，模板2 μL。采用兩步法PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，并于60 ℃ 收集熒光進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)陰性菌及水對(duì)照檢驗(yàn)特異性[7-8]。

表1　大腸桿菌O157和O111的特異性基因rfbE、wbdl引物和探針序列

表2　產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的毒力基因stx1、stx2b、eae引物和探針序列

2　結(jié)果與討論

2.1菌種的培養(yǎng)、分離與純化

奶粉樣品在TSB肉湯混濁生長(zhǎng)；3M PetrifilmTME.coli紙片出現(xiàn)藍(lán)色帶有氣泡單菌落，為大腸桿菌，結(jié)果如圖1所示。O157與O111血清試驗(yàn)?zāi)?；EMB瓊脂培養(yǎng)出典型的具有金屬光澤的深紫色菌落；O157顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)出圓形、較小、淡紫色菌落為大腸桿菌O157，培養(yǎng)出圓形、藍(lán)色單菌落為大腸桿菌O111，結(jié)果見(jiàn)圖2、3。

(a) 稀釋度10-7　(b) 稀釋度10-8

(a) 瓊脂培養(yǎng)基　(b) 顯色培養(yǎng)基

圖2大腸桿菌O157在EMB瓊脂和顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

Fig.2GrowthofE.coliO157onEMBagarandchromogenicagar

2.2熒光PCR鑒定結(jié)果

E.coliO157中rfbE基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，stx1、stx2b、eae基因檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，Ct均小于35，表明凍干奶粉樣品中含有產(chǎn)志賀毒素且產(chǎn)黏附素的大腸桿菌O157型；E.coliO111中wbdl 基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，eae基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，Ct均小于35，其余為陰性，無(wú)擴(kuò)增曲線，表明奶粉樣品中含有不產(chǎn)志賀毒素、產(chǎn)黏附素的大腸桿菌O111型[9-10]，結(jié)果如表3所示。

(a) 瓊脂培養(yǎng)基　(b) 顯色培養(yǎng)基

圖3大腸桿菌O111在EMB瓊脂和顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

Fig.3GrowthofE.coliO111onEMBagarandchromogenicagar

表3凍干奶粉中大腸桿菌O157與O111的熒光PCR鑒定結(jié)果

Tab.3RT-PCRidentificationresultofE.coliO157andO111

基因CtO157O111O157rfbE17.8O111wbdl19.3志賀毒素stx126.7—stx2b19.7—黏附素eae19.218.1注:Ct≥40,可判定樣品結(jié)果為陰性,未檢出致病菌;Ct≤35.0,可判定該樣品結(jié)果為陽(yáng)性?！啊贝砦礄z測(cè)出。

熒光PCR擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，陰性菌及空白對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果如圖4、5所示。

圖4　大腸桿菌O157熒光PCR擴(kuò)增曲線

圖5　大腸桿菌O111熒光PCR擴(kuò)增曲線

3　結(jié)　論

本實(shí)驗(yàn)將傳統(tǒng)培養(yǎng)法與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)結(jié)合，利用3M EC紙片法初步判斷樣品中含有大腸桿菌，通過(guò)血清學(xué)鑒定以及菌落特征的差異將兩種致病菌分離純化，以特異基因rfbE和wbdl及STEC特異性毒力基因stx1、stx2b、eae作為大腸桿菌O157和O111檢測(cè)的靶基因，設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)凍干奶粉樣品中的大腸桿菌，并研究致病菌的產(chǎn)毒情況。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線光滑平穩(wěn)，Ct均小于35，凍干奶粉樣品中含有E.coliO157和O111，E.coliO157產(chǎn)志賀毒素與黏附素，E.coliO111不產(chǎn)志賀毒素而產(chǎn)黏附素。

僅依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可以檢測(cè)出大腸桿菌，卻無(wú)法進(jìn)一步對(duì)該致病菌的攜帶毒素情況以及危害能力進(jìn)行檢測(cè)。目前世界范圍內(nèi)對(duì)STEC仍缺乏有效的控制手段，STEC致病能力很強(qiáng)，是一類危害嚴(yán)重的食源性病原菌，攜帶志賀毒素(stx1、stx2)基因是其共有的一個(gè)特征，該基因是疾病最終發(fā)展成為溶血性尿毒綜合征HUS的關(guān)鍵因素，緊密黏附素eae可與stx1/stx2相互作用導(dǎo)致腎臟損傷。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物、探針用于實(shí)時(shí)熒光PCR，Ct平均值為20，較其他相比敏感性有較大提高，具有廣闊的應(yīng)用前景和較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為STEC的檢測(cè)和攜帶毒素情況及其致病情況的研究提供了一種有效的檢測(cè)方法[9,11]。產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌的流行情況及各個(gè)毒力因子的致病作用，對(duì)食品衛(wèi)生公共安全有著重要的意義，STEC對(duì)人類的危害不容忽視。

[1] 劉飛,宋定州,李鍵,等.產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的流行病學(xué)及致病因子的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,41(1):187-191.

[2] 陳洪章,鄒全明.腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7志賀毒素研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(1):83-85.

[3] 徐德順,沈月華,程平慶.大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)方法的建立[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,21(4):174-177.

[4] 張建華,陸群英,程蘇云,等.實(shí)時(shí)PCR在大腸桿菌O157:H7快速檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2007,23(8):839-841.

[5] 郝江燕,胡文忠,馮敘橋,等.食品中大腸桿菌生物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2013,34(15):370-374.

[6] 曠代,潘海建,楊筱薇,等.產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌流行病學(xué)及主要毒力因子研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(8):180-184.

[7] 周微,張偉欽,付宇,等.熒光定量PCR方法快速檢測(cè)原料乳中的大腸桿菌[J].中國(guó)乳品工業(yè),2009,37(19):39-42.

[8] 胡慧,陳雅君,段志剛,等.大腸桿菌O157:H7特異基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J].食品科學(xué),2011,32(12):278-282.

[9] 孫慶元,王建軍,劉建文,等.抗大腸桿菌熒光抗體的制備及其特性[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,31(5):322-325.

[10] 王昊宇,張公亮,侯紅漫.應(yīng)用SYBR Green Ⅰ溶解曲線檢測(cè)食源性單增李斯特菌[J].食品工業(yè)科技,2013,34(3):77-78.

[11] IZHAR U H, VIC G, ROB K, et al. Development of a rapid quantitative PCR assay for direct detection and quantification of culturable and non-culturableEscherichiacolifrom agriculture watersheds[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(3): 480-488.

Detection method forEscherichiacoliO157 and O111 in lyophilized milk powder

CAOWenbo1,ZHENGQiuyue2,ZHANGGongliang1,HOUHongman1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian 116001, China )

TherealtimefluorescencePCRwasappliedtoestablishadetectionmethodforEscherichia coliO157andO111inlyophilizedmilkpowder. E. coliO157andO111wereisolatedandpurifiedthroughtraditionalculturemethod,andtheprimersandprobesweredesignedbasedontherfbEgeneandwbdlgeneofE. coliO157andO111.ConsideringthepossibilityofSTEC,theprimersandprobesweredesignedbasedonthetoxingenesstx1, stx2b, eaeandthegenesweredetectedbyRT-PCR.TheresultsshowedthatlyophilizedmilkpowderwascontaminatedbyE. coliO157andO111. Stx1andstx2bgenesweredetectedinE. coliO157whichcouldproduceShigatoxinandadhesin,whiletheeaegenewasdetectedinE. coliO111whichcouldproduceadhesin. E. coliO157andO111couldbeseparatedaccuratelybyRT-PCRmethod,indicatingthemethodcouldbeusedinquicklydetectingforthepathogensandtoxingenesinhighsensitivityandspecificity.

EscherichiacoliO157;EscherichiacoliO111; real-time PCR; lyophilized milk powder

2015-03-06.

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201210043).

曹文博(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：張公亮(1978-)，男，副教授.

TS207.4

A

1674-1404(2016)05-0317-04

曹文博,鄭秋月,張公亮,侯紅漫.凍干奶粉樣品中大腸桿菌O157和O111的檢測(cè)方法[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,35(5):317-320.

CAO Wenbo, ZHENG Qiuyue, ZHANG Gongliang, HOU Hongman. Detection method forEscherichiacoliO157 and O111 in lyophilized milk powder[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(5): 317-320.