張 元 圣，　田 　 晶，　高 　 鵬

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 分離分析化學(xué)重點實驗室, 遼寧 大連　116023 )

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釀酒酵母糖酵解途徑的動態(tài)模擬

張 元 圣1,2，田 晶1，高 鵬2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 分離分析化學(xué)重點實驗室, 遼寧 大連116023 )

利用葡萄糖脈沖對釀酒酵母厭氧連續(xù)培養(yǎng)物施加擾動，通過不同時間點取樣,定量細胞內(nèi)外主要化合物的含量。利用測定的數(shù)據(jù)和細胞內(nèi)糖酵解途徑模型進行各反應(yīng)途徑的參數(shù)估計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實際測量值與預(yù)測值接近。代謝控制分析發(fā)現(xiàn)，糖酵解途徑中，磷酸果糖激酶、己糖激酶和己糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有較大的通量控制系數(shù)。隨機改變細胞內(nèi)外化合物的濃度對細胞能荷狀態(tài)的模擬結(jié)果顯示，釀酒酵母能在1 min內(nèi)將細胞的能荷狀態(tài)恢復(fù)到初始水平。

釀酒酵母；糖酵解；動態(tài)模擬

0　引　言

釀酒酵母是最先完成基因組測序并且在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域被廣為使用的單細胞真核生物。隨著認識能力和認識手段的不斷提高和改善，經(jīng)驗式的單個基因的遺傳操作已經(jīng)很難滿足大幅度提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。因此代謝工程的概念在20世紀(jì)90年代初被提出，并不斷在實踐中得到發(fā)展和完善[1]，繼而代謝通量分析(metabolic flux analysis, MFA)、代謝控制分析(metabolic control analysis, MCA)等許多方法都被引入代謝工程領(lǐng)域，以輔助更好地了解細胞的代謝特征和篩選潛在的改造靶點。但是無論MCA還是MFA都基于一個基本的假設(shè)和前提——細胞處于代謝的擬穩(wěn)態(tài)[2-3]。但實際發(fā)酵過程中擬穩(wěn)態(tài)通常很難實現(xiàn)，而且細胞的生長代謝是個動態(tài)過程，僅僅考察一個狀態(tài)下的特征不能反映細胞的真實代謝特性和代謝潛能，而動態(tài)模擬(dynamic modeling)卻能反映出細胞的瞬時代謝特征[4]，在應(yīng)用上不受細胞培養(yǎng)狀態(tài)的限制。動態(tài)模擬的一個主要障礙來源于細胞內(nèi)許多代謝過程的動力學(xué)參數(shù)相對缺乏[5]，因此對細胞進行實時動態(tài)分析顯得尤為重要。許多胞內(nèi)代謝物的轉(zhuǎn)換時間非常短暫，特別是中間代謝產(chǎn)物和輔因子，比如ATP和6-磷酸葡萄糖的轉(zhuǎn)換時間都在1～2 s[6]，相應(yīng)的快速取樣裝置也應(yīng)運而生，并且伴隨產(chǎn)生了一系列分析測定方法。在本研究中，結(jié)合實際工藝需要，為了獲取厭氧糖酵解過程中的所有動力學(xué)參數(shù)，首先對處于擬穩(wěn)態(tài)的釀酒酵母培養(yǎng)物施加葡萄糖底物脈沖，在不同時間點取樣，分別測定細胞內(nèi)外主要化合物的量，以該數(shù)據(jù)進行參數(shù)估計。利用所得數(shù)據(jù)分別進行MCA和細胞能荷狀態(tài)模擬，找到糖酵解途徑的關(guān)鍵控制步驟并分析細胞對能荷狀態(tài)的調(diào)整情況。

1　材料與方法

1.1菌株和培養(yǎng)方法

釀酒酵母菌株為CEN.PK113-7D培養(yǎng)基為葡萄糖限制培養(yǎng)基[7]。連續(xù)培養(yǎng)稀釋速率為D=0.1 h-1，補料速率為0.2 L/h，葡萄糖濃度為277.7 mmol/L，培養(yǎng)溫度為30 ℃，2.0 L厭氧發(fā)酵罐KLF 2000(Bioengineering,Wald,瑞士)內(nèi)培養(yǎng)。厭氧條件實現(xiàn)為1.76 L/min恒流氮氣。2 mol/L NaOH 控制pH=5.0。該條件下恒化培養(yǎng)物CDW為3.491 g/L。培養(yǎng)液中比生物量為420 g/L(以細胞溶質(zhì)體積計)。經(jīng)7倍罐體積后施加4.682 mL的400 g/L葡萄糖脈沖。細胞內(nèi)和發(fā)酵液內(nèi)化合物測定使用GC-MS和HPLC方法完成[8-9]，取樣間隔2 s。

1.2模型和軟件

厭氧釀酒酵母的糖酵解模型參考文獻[10]，微分方程和反應(yīng)方程式見參考文獻[11]。參數(shù)估計利用SBPD和SBTOOLBOX 2.0在Matlab v7.4平臺下完成。MCA和能荷模擬利用COPASI 4.5軟件完成。

2　結(jié)果與討論

2.1參數(shù)估計結(jié)果

細胞內(nèi)化合物在穩(wěn)態(tài)條件下的濃度見表1[12]。參數(shù)估計利用測定的葡萄糖脈沖后不同時間點的細胞內(nèi)AMP、ADP、ATP、NAD，果糖-6-磷酸(F6P)，葡萄糖-6-磷酸(G6P)，丙酮酸(Pyr)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的濃度信息進行擬合。參數(shù)估計的結(jié)果見圖1，從圖中可見實際測量值與利用參數(shù)估計值對化合物細胞內(nèi)含量的計算基本吻合，說明模型參數(shù)基本合理[8]。

表1　細胞內(nèi)部分化合物穩(wěn)態(tài)條件下的濃度

2.2MCA結(jié)果

利用“2.1”模型參數(shù)，系統(tǒng)可以達到一個穩(wěn)態(tài)，對該狀態(tài)下的MCA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有3個酶的催化步驟的通量控制系數(shù)(FCC)最大，分別是HXT、HK和PFK，如圖2所示。

2.3能荷模擬結(jié)果

隨機改變細胞內(nèi)化合物的濃度在1/2～2倍、細胞外葡萄糖濃度在20～80 mmol/L，模擬時長5 min。做200次細胞內(nèi)的能荷狀態(tài)模擬，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可見，細胞在1 min內(nèi)將能荷狀態(tài)調(diào)整到初始水平為0.8左右。

動態(tài)模擬在以下方面具有其他計算生物學(xué)方法所不具備的優(yōu)勢：(1)可以通過模擬過程動態(tài)跟蹤某化合物或過程的變化細節(jié)；(2)能通過對細胞內(nèi)相對容易定量的化合物推算無法定量或不容易準(zhǔn)確定量的化合物，因此動態(tài)模擬比靜態(tài)分析能提供更多細節(jié)信息。本研究中發(fā)現(xiàn)影響細胞厭氧狀態(tài)下糖酵解途徑的限速步驟主要體現(xiàn)在初始幾個步驟，特別是葡萄糖利用的第一步具有較大的FCC，幾乎都超過0.5。而傳統(tǒng)意義上認為的限速步驟即PFK催化的不可逆反應(yīng)的FCC不足0.2，說明葡萄糖的吸收速度決定了糖酵解途徑的運轉(zhuǎn)效率。此結(jié)果的發(fā)現(xiàn)與文獻[9]中的描述相一致。該結(jié)果也提示在提高目標(biāo)產(chǎn)物的改造中，可能更應(yīng)該關(guān)注葡萄糖轉(zhuǎn)運體的特征，因為已有資料證實釀酒酵母在12和30 ℃生長時，糖酵解途徑的酶并無顯著表達量變化，但HXT表達量卻顯著不同，因此證明代謝控制比基因表達量的變化對糖酵解途徑的效率影響更為顯著[11]。

能量代謝是細胞進行其他生理活動的基礎(chǔ)，在葡萄糖限制性培養(yǎng)基和有氧條件下，釀酒酵母通常能維持能荷狀態(tài)在0.8～0.9[12]。雖然保持

圖1　細胞內(nèi)化合物預(yù)測結(jié)果(實線)與實際結(jié)果(虛線)的比較

圖2　3種通量控制系數(shù)較大的酶的通量控制系數(shù)比較

圖3　隨機模擬細胞內(nèi)能荷變化

能量代謝的穩(wěn)定十分重要，但是能荷狀態(tài)并不總是十分穩(wěn)定，比如在同型乳酸發(fā)酵過程中，ATP可以被大量消耗而低水平的再生，細胞雖然仍能保持生活狀態(tài)，但是合成代謝等許多基本活動會受到抑制[13]。在不同溫度培養(yǎng)條件下，低溫會導(dǎo)致能荷水平一定程度的提高，以滿足代謝需要[10]。本研究的結(jié)果提示，在一定范圍內(nèi)的代謝物濃度變化，僅在初始階段會顯著降低細胞的能荷狀態(tài)，但是隨后細胞就會在極短時間內(nèi)將其恢復(fù)到初始狀態(tài)水平，圖1中的結(jié)果也提示細胞內(nèi)多數(shù)代謝物的大幅度波動都發(fā)生在最初1 min內(nèi)，說明細胞對外界的變化響應(yīng)十分迅速。

3　結(jié)　論

本研究通過測定葡萄糖脈沖擾動后釀酒酵母厭氧連續(xù)培養(yǎng)物細胞內(nèi)外主要化合物的含量變化，并以此為基礎(chǔ)結(jié)合細胞內(nèi)糖酵解途徑模型進行了各反應(yīng)途徑的參數(shù)估計，證明糖酵解途徑中，磷酸果糖激酶、己糖激酶和己糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有較大的通量控制系數(shù)，同時細胞能荷狀態(tài)的模擬顯示，釀酒酵母能在1 min內(nèi)將細胞的能荷狀態(tài)恢復(fù)到初始水平。

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Dynamic modeling glycolysis pathway ofSaccharomycescerevisiae

ZHANGYuansheng1,2,TIANJian1,GAOPeng2

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China )

AglucosepulsewasexertedonthecontinuouscultureofSaccharomyces cerevisiae.Themajorintercellularmetabolitesweredeterminedfromculturessampledatdifferenttimepoints.Parameterestimationwasconductedusingthequantitationdataandaglycolysismodel,whichshowedagoodmatchoftheobservedandcalculatedresults.Metaboliccontrolanalysisshowedthathexosetransportsystem,hexosekinaseandphosphofructokinasehadhighfluxcontrolcoefficients.Simulationresultperformedbyrandomlychangingtheinter-andintra-cellularconcentrationsofthemetabolitesindicatedthatcellscouldrestoretheirenergychargestateswithinoneminute.

Saccharomycescerevisiae; glycolysis; dynamic modeling

2015-03-13.

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2013020167).

張元圣(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：田 晶(1966-)，女，教授.

TS261.1；Q932

A

1674-1404(2016)05-0313-04

張元圣,田晶,高鵬.釀酒酵母糖酵解途徑的動態(tài)模擬[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(5):313-316.

ZHANG Yuansheng, TIAN Jian, GAO Peng. Dynamic modeling glycolysis pathway ofSaccharomycescerevisiae[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2016, 35(5): 313-316.