吳寶升 ，孫海洲 ，桑 丹 ，李勝利 ，張春華 ，張崇志 ，金 鹿 ，艷 城 ，珊 丹

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

精氨酸對妊娠后期鄂爾多斯細毛羊胎兒生長發(fā)育的影響研究

吳寶升1，孫海洲2，桑 丹2，李勝利2，張春華2，張崇志2，金 鹿2，艷 城1，珊 丹2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

旨在通過對鄂爾多斯細毛羊母羊頸靜脈灌注L-精氨酸，研究其對鄂爾多斯細毛羊母羊妊娠后期（90～140 d）胎兒生長與發(fā)育的影響。試驗選擇22只母羊，在90 d開始灌注115 μmol L-Arg-HCl/kg體重（Arg1組）、155 μmol L-Arg-HCl/kg體重（Arg2組）和生理鹽水（對照組），3 次/d。 妊娠第 115 天和第140天，進行實驗?zāi)秆蛟畜w檢查，并記錄胎兒體重、器官重量和體尺長度，收集母體及胎兒血漿測定血漿氨基酸濃度。結(jié)果表明，母羊妊娠第140天，Arg2組較Arg1組和對照組顯著增加了胎兒心臟和肝臟重量（P＜0.05）。母羊妊娠第115天和第140天，灌注L-精氨酸顯著增加母體血漿精氨酸和鳥氨酸濃度（P≤0.01），增加胎兒血漿生糖氨基酸（蘇氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸）濃度（P≤0.05）。

鄂爾多斯細毛羊；胎兒；L-精氨酸；生長發(fā)育

繁殖母羊是養(yǎng)羊場的核心群體，其繁殖性能的高低決定著羊場生產(chǎn)水平及效益的高低。目前，多胎母羊妊娠后期所出現(xiàn)的嚴重的子宮內(nèi)胎兒發(fā)育遲緩（IUGR）等問題已被廣泛關(guān)注。通過營養(yǎng)調(diào)節(jié)增加胎盤的生長和功能，并促進子宮胎盤血流量增加是提高胎兒生長發(fā)育的有效手段［1］。精氨酸（arginine，Arg）是重要的功能性氨基酸，以往通常認為成年母羊能合成足夠的Arg來滿足自身需要，只有處于生長早期的羔羊因合成量不足而需要在飼料中補充 Arg，但 Wu 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，懷孕母豬羊水和尿囊液中的Arg可能對于胎盤和胎兒的發(fā)育具有重要意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Arg和Arg族氨基酸及其代謝產(chǎn)物（一氧化氮、多胺等）能夠刺激胎盤的生長。母體營養(yǎng)物質(zhì)的充分轉(zhuǎn)運可促進胚胎或胎兒的存活、生長和發(fā)育。Wu等［3］通過對母畜妊娠期胎兒氨基酸組成與沉積規(guī)律的研究發(fā)現(xiàn)，隨著妊娠階段的延續(xù)，與非氮類干物質(zhì)相比，胎兒體內(nèi)氮以及氨基酸的沉積速度增加，而且Arg是主要的氮載體。在妊娠后期，子宮吸收的Arg和脯氨酸幾乎全部用于沉積，表明Arg可能是后期胎兒生長的限制性氨基酸，Arg不足時造成IUGR的主要因素。盧巖等［4］通過大鼠試驗已經(jīng)證明，食物中給予L-精氨酸（L-Arg）可改善低壓性缺氧所導致的胎鼠IUGR及體重下降，防止IUGR鼠老齡期高血壓及蛋白尿的發(fā)生。但目前Arg對母羊的營養(yǎng)生理作用國內(nèi)外報道很少，該試驗研究了基礎(chǔ)日糧之外補充不同水平L-Arg對妊娠后期母羊繁殖性能的影響，旨在為研發(fā)優(yōu)質(zhì)妊娠后期母羊飼料及提高胎兒生長發(fā)育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 經(jīng)過同期發(fā)情處理的母羊在B超妊娠診斷后確認懷孕的鄂爾多斯細毛羊共22只，均體況良好，體重為（57.6±5.8）kg（均值±SEM）。 妊娠第75天，每個實驗?zāi)秆蚨既︷B(yǎng)在單個的羊籠子里飼喂基礎(chǔ)日糧，日糧過渡期為5 d（即到妊娠第80天）。妊娠第80天，飼喂100%NRC推薦的基礎(chǔ)日糧（滿足妊娠雙胎母羊需要量為26.2 g/kg體重，NRC 1985），自由飲水，每天飼喂 2 次（8：00 和 17：00）。妊娠期基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)含量見表1。

1.2 方法 從妊娠第90天開始，實驗?zāi)秆螂S機分為3組進行頸靜脈灌注生理鹽水或者L-精氨酸鹽酸（L-Arg-HCl）溶液。其中，對照組灌注無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉，n=8 只）、Arg1 組灌注 115 μmol L-Arg-HCl/kg體重 （n=7只）和Arg2組灌注155 μmol L-Arg-HCl/kg體重（n=7只），每組實驗?zāi)秆蚨脊嘧?3 次/d（7：00、15：00 和 23：00）。這些 L-精氨酸劑量的選擇是依據(jù)Lassala等［5-6］研究結(jié)果制備。母羊每間隔7 d稱1次體重，并根據(jù)體重情況對采食量和注射劑量進行及時調(diào)整。

1.3 樣品收集及處理 在妊娠第90天、第115天和第140天，靜脈灌注生理鹽水或者L-Arg-HCl 1 h后從頸靜脈采集母體血樣各10 mL，裝于帶有肝素鈉抗凝劑的離心管，3 500 r/min離心15 min收集血漿，并-20℃冷凍保存待測。

同時在妊娠第115天和第140天，對母羊進行孕體發(fā)育檢查。母羊放血后立即取出子宮，然后分別取出尿囊液和羊水，并記錄體積。之后，立刻用帶肝素鈉的離心管收集胎兒心臟血樣，并離心、分裝、保存待測。將胎兒進行稱重、測量和解剖。同時記錄母羊體重。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)水平

表2 妊娠第90～140天母羊體重變化d，kg

1.4 測定血漿氨基酸 母體和胎兒血漿氨基酸是由北京普瑞華盛生物科技有限公司通過高效液相色譜—四級桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀 （HPLC-MS/MS API3200 Q-TRAP）檢測血漿游離氨基酸濃度。

1.5 統(tǒng)計分析 母體和胎兒體重數(shù)據(jù)用SAS 9.0進行單因素（one-way）ANOVA分析統(tǒng)計學意義，其中，胎兒數(shù)量（單羔和雙羔）作為協(xié)方差。試驗數(shù)據(jù)采用單因素ANOVA進行分析，不同處理組之間差異顯著性采用SNK多重比較 （student-newmankeuls multiple test），結(jié)果表示為均值±SEM，其中，P≤0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 母羊體重變化 由表2可知，L-Arg-HCl灌注對妊娠母羊活體體重無顯著性影響（P＞0.05），然而妊娠第140天的Arg處理組較對照組母羊活體體重更重（P=0.07）。 在妊娠第 90～140天，灌注 L-Arg-HCl對母羊體重變化還是有明顯增加，分別在體重變化時間段為 140 d-90 d、140 d-76 d和 140 d-115 d的P值為0.04、0.04和0.07。妊娠前115 d內(nèi)，試驗組和對照組的母羊體重變化不顯著（P＞0.05）。

2.2 胎兒體重和器官重量 由表3可知，妊娠第115天精氨酸補充對胎兒體尺和器官重量沒有影響（P＞0.10），但是對胎兒體重有影響。其中，Arg2組較對照組的胎兒體重更重 （P=0.05），而Arg1組與其他兩組無顯著差別。然而，在妊娠第140天L-Arg-HCl灌注對胎兒的肝臟（P=0.06）、心臟和腎周圍脂肪重量（P＜0.05）影響明顯，但是對其他器官的影響不顯著。此時，Arg2組腎周圍的脂肪重量較對照組和Arg1組分別增加了41%和49%，心臟重量分別增加了23%和28%。

2.3 母羊和胎兒血漿氨基酸濃度 由表4可知，在妊娠第115天精氨酸處理的2個組較對照組母羊血漿中精氨酸、鳥氨酸和丙氨酸的濃度都有顯著增加（P≤0.01），其中，Arg2組的氨基酸濃度增加更多。到妊娠第140天，通過L-Arg-HCl灌注的母羊血漿中的精氨酸和鳥氨酸濃度提高顯著 （P≤0.001），且甘氨酸濃度也顯著增加（P=0.03），其中Arg2組的相應(yīng)氨基酸濃度最高。

由表5可知，妊娠第115天，母羊精氨酸處理與對照組相比，胎兒血漿中的蘇氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和鳥氨酸均顯著增加，然而絲氨酸卻顯著降低（P≤0.05）。其中，Arg1組苯丙氨酸濃度顯著高于Arg2和對照組 （P=0.04）；Arg2組蘇氨酸和甲硫氨酸濃度顯著高于Arg1組和對照組 （P=0.05）；Arg1組和Arg2組賴氨酸和鳥氨酸濃度顯著高于對照組（P=0.01）。但是，Arg1組和Arg2組絲氨酸濃度卻顯著低于對照組（P=0.04）。到妊娠第140天，鳥氨酸濃度在3組之間差異極顯著 （P≤0.001），其中，Arg2組、Arg1組和對照組中的濃度分別為 333.00、224.60 和 164.60 μmol/L。 然而，Arg1組和Arg2組的賴氨酸濃度卻顯著低于對照組 （P=0.01）。另外，甲硫氨酸濃度在L-Arg-HCl處理后相比對照組具有增加趨勢（P=0.07）。

3 討論

懷多胎的母畜容易出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限，并導致后代的出生體重降低和死亡率增加［7-8］。據(jù)相關(guān)研究報道，多胎母羊妊娠第100～120天注射精氨酸對胎兒生長有影響［5-6］。然而，該試驗更關(guān)注的是雙胎母羊妊娠后期（妊娠第90～140天）在滿足正常飼喂條件下補充精氨酸后對母羊和胎兒體內(nèi)氨基酸和激素循環(huán)以及胎兒生長與發(fā)育過程中的探索評估。Sales等［9-10］研究發(fā)現(xiàn)，在 100%NRC 飼喂條件下母羊單胎的出生體重要比雙胎的顯著高21%，同樣單胎的肌肉重量顯著高于雙胎的肌肉重量。此外，McCoard 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠第 100 天之后雙羔與單羔的體重偏離差距顯著，可達到15%。該試驗中，3個組的懷孕母羊都有單胎和多胎的數(shù)量變化。由于單胎的出生體重通常比雙胎的單個胎兒更重，因此，試驗中使用方差—協(xié)方差矩陣作為胎兒出生體重數(shù)據(jù)的統(tǒng)計模型進行分析。該模型能夠準確地考慮胎兒數(shù)量（單胎或多胎）對胎兒初生體重的影響，并不是簡單地把所有胎兒初生體重的總和計算。該試驗還發(fā)現(xiàn)了2個關(guān)鍵點，一個是母羊灌注L-Arg-HCl增加了血液中精氨酸和鳥氨酸濃度，另一個是提高了多胎母羊胎兒的初生體重。

表4 妊娠第115天和第140天母羊血漿氨基酸濃度的變化 μmol/L

表5 妊娠第115天和第140天胎兒血漿氨基酸濃度的變化 μmol/L

精氨酸作為一氧化氮（NO）和多胺合成的前體物，在促進哺乳動物胎盤血管生成和發(fā)育過程中具有關(guān)鍵作用。其中，一氧化氮（NO）可作為血管舒張和信號分子；多胺可作為DNA和蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控者［12-15］。因此，精氨酸可通過其代謝產(chǎn)物一氧化氮（NO）和多胺來調(diào)節(jié)和改善子宮胎盤血流量和防止出現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限過程中具有非常重要的作用［16-17］，而且對于胎兒出生體重和羔羊產(chǎn)后發(fā)育有潛在的調(diào)節(jié)機制。Lassala等［5-6］研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸能提高四胎兒出生體重和營養(yǎng)不良母羊的單胎兒出生體重，這進一步鞏固了代謝調(diào)節(jié)能夠有效預(yù)防或改善子宮內(nèi)胎兒生長受限的觀念［18-20］。妊娠第115天和第140天，精氨酸處理組與提高胎兒的生長和母體內(nèi)精氨酸和鳥氨酸濃度有聯(lián)系。根據(jù)前人的研究可知，促進胎兒發(fā)育主要是增加了胎盤血管增生和子宮胎盤血流量，并提高母體與胎兒之間的氧氣和營養(yǎng)素的轉(zhuǎn)換，而該過程中一氧化氮（NO）信號分子的調(diào)控作用非常關(guān)鍵［6，21］。鳥氨酸是精氨酸在精氨酸酶作用下的代謝產(chǎn)物，作為尿素循環(huán)的一部分與尿素形成有關(guān)。因此，灌注L-Arg-HCl后鳥氨酸濃度升高，并在鳥氨酸脫羧酶作用下形成多胺，從而進入尿素循環(huán)來促進氨的解毒作用。精氨酸補充后除了增加母體血漿中的精氨酸和鳥氨酸濃度外，還增加了胎兒血漿中的蘇氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸等的濃度。這些氨基酸屬于生糖氨基酸家族的成員，可以代謝轉(zhuǎn)變?yōu)楸?、?酮戊二酸和草酰乙酸，再通過羧酸變成葡萄糖和糖原。

4 結(jié)論

與Arg1組或?qū)φ战M相比，Arg2組的影響顯著增加了生糖氨基酸的濃度，并且L-Arg-HCl處理組的胎兒體重相比對照組具有增加趨勢。在正常飼養(yǎng)水平下，對妊娠后期（妊娠第90～140天）多胎母羊補充精氨酸來增加其血漿精氨酸和相關(guān)氨基酸濃度，還可有效防止胎兒宮內(nèi)生長受限，促進胎兒生長發(fā)育，提高胎兒生存能力。

［1］BAZER F W，SPENCER T E，JOHNSON G A，et al.Comparative aspects of implantation［J］.Reproduction，2009，138（2）：195-209.

［2］WU G，BAZER F W，BURGHARDT R C，et al.Impacts of amino acid nutrition on pregnancy outcome in pigs：mechanisms and implications for swine production ［J］.J Anim Sci，2010，88（13 Suppl）：E195-E204.

［3］WU G，OTT T L，KNABE D A，et al.Amino acid composition of the fetal pig ［J］.Journal of Nutrition，1999， 129（5）：1031-1038.

［4］盧巖，劉曉梅，李書琴.L-精氨酸對宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎鼠胰島素樣生長因子及其結(jié)合蛋白表達的影響 ［J］.中國當代兒科雜志，2006，8（4）：319-322.

［5］LASSALA A，BAZER F W，CUDD T A，et al.Parenteral administration of L-arginine prevents fetal growth restriction in undernourished ewes ［J］.Journal of Nutrition，2010，140（7）：1242-1248.

［6］LASSALA A，BAZER F W，CUDD T A，et al.Parenteral administration of L-arginine enhances fetal survival and growth in sheep carrying multiple fetuses ［J］.Journal of Nutrition，2011，141（5）：849-855.

［7］GOOTWINE E，SPENCER T E，BAZER F W.Litter-sizedependent intrauterine growth restriction in sheep［J］.Animal ：An International Journal of Animal Bioscience，2007，1（4）：547-564.

［8］BLICKSTEIN I.Growth aberration in multiple pregnancy［J］.Obstetrics&Gynecology Clinics of North America，2005，32（1）：39-54.

［9］SALES F，PACHECO D，BLAIR H，et al.Muscle free amino acid profiles are related to differences in skeletal muscle growth between single and twin ovine fetuses near term［J］.Springerplus，2013，2（1）：1-9.

［10］SALES F A，PACHECO D，BLAIR H T，et al.Identification of amino acids associated with skeletal muscle growth in late gestation and at weaning in lambs of well-nourished sheep［J］.Journal of Animal Science，2014，92（11）：5041-5052.

［11］McCOARD S A，McNABB W C，BIRTLES M J，et al.Immunohistochemical detection of myogenic cells in muscles of fetal and neonatal lambs ［J］.Cells Tissues Organs，2001，169（1）：21-33.

［12］WU G，MORRIS S J.Arginine metabolism：nitric oxide and beyond［J］.BiochemicalJournal，1998，336（Pt1）：1-17.

［13］WU G，BAZER F W，CUDD T A，et al.Pharmacokinetics and safety of arginine supplementation in animals ［J］.

Journal of Nutrition，2007，137 （6 Suppl 2）：1673S-1680S.

［14］SHEPPARD C，SHAW C E，LI Y，et al.Endothelium-derived nitric oxide synthase protein expression in ovine placental arteries［J］.Biology of Reproduction，2001，64（5）：1494-1499.

［15］ISHIKAWA T，HARADA T，KOI H，et al.Identification of arginase in human placental villi ［J］.Placenta，2007， 28（2/3）：133-138.

［16］WU G，BAZER F W，WALLACE J M，et al.Board-invited review：intrauterine growth retardation：implications for the animal sciences［J］.Journal of Animal Science，2006，84（9）：2316-2337.

［17］KWON H，SPENCER T E，BAZER F W，et al.Developmental changes of amino acids in ovine fetal fluids［J］.Biology of Reproduction，2003，68（5）：1813-1820.

［18］WU G，BAZER F W，DAVIS T A，et al.Arginine metabolism and nutrition in growth，health and disease［J］.Amino Acids，2009，37（1）：153-168.

［19］WU G，BAZER F W，DAI Z，et al.Amino acid nutrition in animals：protein synthesis and beyond［J］.Annual Review of Animal Biosciences，2014，2（1）：387-417.

［20］WU G，BAZER F W，SATTERFIELD M C，et al.Impacts of arginine nutrition on embryonic and fetal development in mammals［J］.Amino Acids，2013，45（2）：241-256.

［21］WU G，MEININGER C J.Regulation of nitric oxide synthesis by dietary factors ［J］.Annual Review of Nutrition，2002，22（22）：61-86.

Effects of Arginine on Growth and Development of Ordos Fine-wool Sheep Fetuses during Late Gestation

WU Bao-sheng1，SUN Hai-zhou2，Sangdan2，LI Sheng-li2，ZHANG Chun-hua2，ZHANG Chong-zhi2，JIN Lu2，YAN Cheng1，Shandan2
（1.College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Institute of Animal Nutrition and Feed，Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Hohhot 010031，China）

The objective of this study was to evaluate the effects of L-arginine infusion through jugular vein on growth and development of Ordos Fine-wool Sheep fetuses during late gestation.Twenty-two ewes

an i.v.bolus of either 115 μmol/（kg·BW） of Arg-HCl（Arg1 group） or 155 μmol/（kg·BW） of Arg-HCl（Arg2 group） or saline solution （control group） 3 times per day from 90 to 140 days post-pregnancy.On the days 115 and 140 of pregnancy,the ewes were physically examined;The body weight,organ weight and body length of their fetuses were recorded;The concentrations of amino acids in plasma of ewes and fetuses were determined.The results revealed that on the day 140 of pregnancy,the heart weight and liver weight of fetuses in Arg2 group were significantly increased compared with those of fetuses in Arg1 group and control group （P＜0.05）.On the days 115 and 140 of pregnancy,the plasma concentrations of arginine and ornithine of ewes received systematic L-arginine infusion were significantly increased （P≤0.01）,and the plasma concentrations of glucogenic amino acid of their fetuses,including threonine,methionine,phenylalanine and lysine,were also significantly increased （P≤0.05）.

Ordos Fine-wool Sheep；fetuses；L-arginine；growth and development

S816.71；S826.4

A文章順序編號：1672-5190（2016）04-0033-05

2016-04-05

項目來源：2014年引進國際先進農(nóng)業(yè)科學技術(shù) “948”項目（2014-Z41）；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科技創(chuàng)新基金項目（2013CXJJM05）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-40-12）。

吳寶升（1989—），男，碩士研究生，主要研究方向為反芻動物營養(yǎng)。

孫海洲（1970—），男，研究員，博士，碩士生導師，主要研究方向為反芻動物營養(yǎng)。

（責任編輯：慕宗杰）