劉蒙蒙，孫小杰，周正平，肖　欣，袁　丹

(1.遵義醫(yī)學院　病理學教研室，貴州 遵義　563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心電鏡室，貴州 遵義　563099)

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臨床醫(yī)學研究

雌激素對人子宮內膜樣癌JEC細胞中ERα、ERβ及p57kip2表達的影響*

劉蒙蒙1，孫小杰1，周正平2，肖欣2，袁丹1

(1.遵義醫(yī)學院病理學教研室，貴州 遵義563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與生物學研究中心電鏡室，貴州 遵義563099)

目的 研究雌激素干擾人子宮內膜樣癌(endometrioid carcinoma ,EC)JEC細胞后雌激素受體(estrogen receptor,ER)亞型ERα、ERβ及p57kip2在細胞中的表達變化。方法 分別用含有3種不同濃度的雌二醇(β-Estradiol, E2)(10-6mol/L,10-8mol/L,10-10mol/L)的培養(yǎng)基進行JEC細胞的體外培養(yǎng)，用不含藥物的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，作為對照，于培養(yǎng)24、48、72h后，用光鏡及電鏡觀察E2干擾后JEC細胞的形態(tài)改變，用MTT法檢測JEC細胞的增殖情況，用Western Blot (WB)法檢測JEC細胞中ERα、ERβ、p57kip2蛋白的表達情況。結果 形態(tài)改變及增殖情況：E2濃度較低時可促進JEC細胞的生長(P<0.05)，高濃度的E2則抑制JEC細胞的生長，但差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)；與對照組比較，E2低濃度組JEC細胞微絨毛及胞質中分泌泡均有所減少，E2高濃度組JEC細胞微絨毛及胞質中分泌泡均有所增多。WB結果顯示，實驗各組及對照組ERα均不表達，ERβ則弱表達；隨著E2作用濃度的增加、作用時間的延長，ERβ與p57kip2蛋白的表達均呈遞增趨勢(P<0.05)。結論 JEC細胞中ERα表達缺失。雌激素可上調ERβ、p57kip2在EC中的表達，具有時間依賴性和濃度依賴性；雌激素濃度較低時可以促進JEC細胞增殖，細胞的分化向較差的方向發(fā)展。

子宮內膜癌；雌激素；ERα；ERβ；p57kip2

子宮內膜癌(endometrial carcinoma)是最常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的身體健康，其病理組織學類型70%～80%為子宮內膜樣癌(endometrioid carcinoma,EC)[1]。子宮內膜癌是一種激素依賴性腫瘤，其發(fā)病因素與內分泌調控紊亂、肥胖、月經(jīng)來潮過早、絕經(jīng)延遲、遺傳等有關，其中缺乏孕激素對抗的高雌激素(estrogen，E)刺激與其發(fā)生發(fā)展密切相關[2]。雌激素與ER結合后可促進子宮內膜腺上皮細胞的增殖，引起子宮內膜腺體增生和內膜增厚，導致子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。ER主要有ERα、ERβ兩種亞型，在很多腫瘤組織中有表達。與正常子宮內膜相比，子宮內膜癌組織細胞中ER蛋白的表達下降[4]。

腫瘤的發(fā)生還與細胞周期調控紊亂有關[5]。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKI)分為INK4和Cip/Kip兩大家族，p57kip2是Cip/Kip家族中的一員，在細胞周期的G1-S期、G2-M期可發(fā)揮負向調控作用，被認為是一種腫瘤抑制基因[5]。本研究擬通過對E2干擾下人EC細胞(JEC細胞株)的培養(yǎng)，用倒置顯微鏡、透射電鏡、MTT、WB等實驗儀器與方法，觀察與檢測E2干擾下JEC細胞的生長情況及ERα、ERβ、p57kip2蛋白的表達情況，以進一步探討雌激素、細胞周期調控紊亂與子宮內膜癌的關系。

1　材料與方法

1.1細胞株人子宮內膜樣癌中分化JEC細胞株由遵義醫(yī)學院微生物教研室提供。

1.2試劑雌二醇購自北京華邁科公司，MTT相關試劑購自南京凱基公司， p57kip2、ERα、ERβ鼠抗人單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體及WB有關試劑均購自上海碧云天生物研究所。

1.3儀器倒置顯微鏡DM4000B(德國Leica公司)，透射電子顯微鏡H-7650(日本日立公司)，WB相關儀器(BIO-RAD公司)。

1.4方法

1.4.1細胞培養(yǎng)及藥物分組用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下體外培養(yǎng)JEC細胞。取對數(shù)生長期的細胞，分別用含有3種不同濃度E2(10-6mol/L,10-8mol/L,10-10mol/L)的培養(yǎng)基進行JEC細胞的體外培養(yǎng)，另取一組不加E2的細胞作為對照組，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后進行后續(xù)實驗，所有實驗均重復3次。

1.4.2MTT法觀察細胞生長情況96孔板培養(yǎng)細胞后，PBS沖洗各孔，每孔加20 μL MTT，4 h后再用PBS沖洗后各加100 μL 二甲基亞砜(DMSO)，用酶標儀檢測490 nm 波長處JEC細胞的吸光光度值(OD值)。

1.4.3倒置顯微鏡觀察細胞生長情況將對數(shù)生長期的JEC細胞制成濃度為1×106/mL的單細胞懸液，接種于6孔板，其中3孔分別加入含不同濃度(10-6mol/L,10-8mol/L,10-10mol/L)E2的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，另取一孔細胞不加E2，作為對照組，每組細胞設3個復孔(3個6孔板同時進行實驗)，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.4.4透射電鏡觀察細胞形態(tài)變化將實驗組及對照組JEC細胞制成單細胞懸液，離心后加入2.5%戊二醛固定液前固定、1%餓酸后固定、梯度脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、電子染色，在H-7650透射電鏡下觀察細胞的超微結構變化。

1.4.5WB法檢測細胞中ERα、ERβ、p57kip2蛋白的表達情況將4組JEC細胞分別提取細胞總蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制說明書配制分離膠和濃縮膠，將細胞蛋白與上樣緩沖液按4∶1的比例混勻后沸水煮5 min，加樣至濃縮膠的加樣孔，電泳。取出凝膠，切下目的蛋白所在區(qū)域的凝膠后轉膜，封閉。取出膜分別放入對應的一抗(β-actin、p57kip2、ERα、ERβ鼠抗人單克隆抗體)稀釋液中，4 ℃過夜。用TBST洗膜3次后放入山羊抗鼠熒光單克隆抗體稀釋液中，置搖床上室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，Odyssey系統(tǒng)掃描成像，測出目的蛋白與內參蛋白的灰度值后作比即為目的蛋白的相對含量。

2　結果

2.1MTT法觀察E2干擾后JEC細胞的生長情況與對照組相比，中、低濃度(10-8mol/L,10-10mol/L )E2對JEC細胞有促增殖作用(P<0.05)，且有時間依賴性，高濃度(10-6mol/L) E2則可抑制JEC細胞的生長，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖 1)。

圖1　E2各濃度組作用JEC細胞24、48、72、96 h的生長曲線

2.2倒置顯微鏡下觀察E2干擾后JEC細胞的生長情況與對照組相比，E2中、低濃度組細胞密度增大，E2高濃度組細胞密度減小，各組細胞形態(tài)變化不明顯(見圖2)。

A:對照組；B:低濃度組；C:中濃度組； D:高濃度組。　　圖2　E2各濃度組作用JEC細胞72h后JEC細胞生長情況(×100)

2.3透射電鏡下觀察E2干擾后JEC細胞的形態(tài)結構變化與對照組比較，E2低濃度組JEC細胞表面微絨毛及胞質中分泌泡均減少，高濃度組JEC細胞表面微絨毛及胞質中分泌泡均有所增多(見圖3)。

A:對照組；B:低濃度組；C:中濃度組；D:高濃度組?！　D3　E2各濃度組作用JEC細胞72 h后JEC細胞形態(tài)變化(bar=5.0 μm)

2.4WB檢測E2干擾后JEC細胞中ERα、ERβ、p57kip2蛋白的表達情況

2.4.1WB檢測E2干擾后JEC細胞中ERα蛋白的表達情況對照組及E2干擾下的JEC細胞均無ERα蛋白的表達(見表1、圖4～6)。

2.4.2WB檢測E2干擾后JEC細胞中ERβ蛋白的表達情況相同藥物濃度比較：隨著E2干擾時間的延長，ERβ蛋白的表達量增加，其中24 h與72 h比較，中、高濃度組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；相同作用時間比較：隨著藥物濃度的增高，ERβ蛋白的表達量增加，其中低、高濃度組在48 h與72 h比較時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，中、高濃度組在48 、72 h差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1、圖4～6)。

2.4.3WB檢測E2干擾后JEC細胞中p57kip2蛋白的表達情況相同藥物濃度比較：中、高濃度組p57kip2蛋白隨E2干擾時間的延長表達增加，其中高濃度組在24 h與72 h比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中濃度組在72 h與24、48 h比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相同作用時間比較：24 h時，高濃度組p57kip2蛋白表達量最高，中濃度組表達量最低，3組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，48 h與72 h時，p57kip2蛋白表達量隨藥物濃度的增高而增高，48 h高濃度組與對照組、低濃度組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，72 h低濃度組與高、中濃度組及對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1、圖4～6)。

培養(yǎng)時間(h)組別ERβp57kip2ERα24對照組0.039±0.0061.42±0.072-低濃度組0.043±0.0081.13±0.100■-中濃度組0.047±0.006●1.13±0.064■-高濃度組0.052±0.011▲1.17±0.194&■-48對照組0.039±0.0151.12±0.102-低濃度組0.044±0.007◆0.95±0.082#-中濃度組0.064±0.012※1.13±0.109-高濃度組0.072±0.025※1.40±0.176★-72對照組0.032±0.0031.56±0.106-低濃度組0.045±0.010▼1.23±0.059▽-中濃度組0.071±0.012△1.52±0.100◇-高濃度組0.072±0.009△1.61±0.120-

※與48 h對照組比較，△與72 h對照組比較，◆與48 h中、高濃度組比較，▼與72 h中、高濃度組比較，●與72 h中濃度組比較，▲與48、72 h高濃度組比較，■與24 h對照組比較，★與48 h對照組、低濃度組比較，▽與72 h中、高濃度組及對照組比較，#與24、72 h低濃度組比較，◇與24、48 h中濃度組，&與72 h高濃度組比較，P<0.05。

A:對照組；B:低濃度組；C:中濃度組； D:高濃度組?！　D4　WB檢測E2各濃度組作用JEC細胞24h后ERα、ERβ、 p57kip2蛋白的表達情況

A:對照組；B:低濃度組；C:中濃度組； D:高濃度組。　　圖5　WB檢測E2各濃度組作用JEC細胞48 h后ERα、ERβ、 p57kip2蛋白的表達情況

A:對照組 ；B:低濃度組；C:中濃度組；D:高濃度組?！　D6　WB檢測E2各濃度組作用JEC細胞72h后ERα、ERβ、 p57kip2蛋白的表達情況

2.5E2干擾后JEC細胞中ERβ、p57kip2蛋白表達的相關性分析P=0.054>0.05，r=0.324，按α=0.05檢驗水準，尚不能認為ERβ、p57kip2蛋白表達之間有相關關系。

3　討論

近年來，在我國大中城市，子宮內膜癌的發(fā)病率逐年升高，其中最常見的為雌激素依賴型子宮內膜癌[6]。雌激素主要通過與ER結合形成激素-受體復合物二聚體調節(jié)靶基因的轉錄[7]；此外，雌激素還可以通過不依賴于ER的非經(jīng)典調控模式促進子宮內膜細胞增殖、抑制細胞凋亡[8-9]。本實驗結果顯示，用含不同濃度E2的培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮內膜癌JEC細胞，與對照組相比，中、低濃度E2均促進細胞增殖，高濃度E2則抑制細胞增殖；電鏡觀察結果顯示，與對照組JEC細胞相比，E2低濃度組JEC細胞微絨毛及胞質中分泌泡減少，E2高濃度組JEC細胞微絨毛及胞質中分泌泡增多。提示低濃度雌激素可以促進JEC細胞增殖，細胞分化向較差的方向發(fā)展；高濃度雌激素則抑制JEC細胞增殖，細胞分化向較好的方向發(fā)展。

ER主要有ERα和ERβ兩種核受體。經(jīng)典的雌激素受體為ERα，ERβ為新發(fā)現(xiàn)的雌激素受體。ERα和ERβ在不同組織中表達不一致，且介導的轉錄激活特性也可表現(xiàn)出相反的效應，E2由ERα介導表現(xiàn)為激活轉錄，從而誘導腫瘤細胞增殖；而ERβ介導則可抑制轉錄，并可抑制ERα的表達，提示在腫瘤發(fā)生過程中ERβ可能起到抑癌基因的作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)ERβ可促進乳腺癌的轉移[10]。有研究表明[4]，與正常子宮內膜組織相比，子宮內膜癌組織中ERα和ERβ兩種受體的表達均有減少，因此推測兩種受體均與子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展有關。也有研究發(fā)現(xiàn)，ERα受體的低表達或表達缺失與子宮內膜癌細胞的惡性轉變呈正相關[11]。ERβ在子宮內膜癌中的研究較少，但有研究發(fā)現(xiàn)[12]，ERβ在晚期和有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者中表達有所增加。且研究表明[13]，子宮內膜癌的惡性轉變與ERα/ERβ mRNA的比值降低有關。以上研究說明ERα和ERβ在子宮內膜癌中的表達異常與在其他腫瘤組織中的表達并不完全一致，推測可能與雌激素的不同調控有關,提示子宮內膜癌的發(fā)生及預后需要同時分析ERα和ERβ兩種受體。本實驗所選用人EC中分化細胞株JEC細胞為吳中明[14]所建，已通過酶聯(lián)親和組化法(S-P法)被證實為ER陰性細胞株，但并未進行ER亞型的檢測。本實驗結果顯示，對照組及E2作用組JEC細胞均無ERα表達，ERβ表達較弱；E2作用于JEC細胞后，與對照組比較，各組細胞ERβ表達量隨E2干擾時間的延長、藥物濃度的增高而提高。提示JEC細胞為 ERα表達缺失、ERβ弱表達的細胞株；雌激素可促進EC細胞中ERβ的表達，且有時間和濃度依賴性。

p57kip2基因位于染色體11p15.5上[15]，屬于CIP/KIP家族的重要成員，在G1-S期、G2-M期阻滯細胞周期的進行[16]。研究顯示[17-18]，p57kip2在肝癌組織細胞中表達降低，且其表達量的降低與腫瘤體積增大、TNM分期增高、浸潤轉移存在正相關。Guo[19]研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2表達的增高可以抑制卵巢癌細胞的增殖和轉移。此外，p57kip2在絕大多數(shù)乳腺癌中表達也降低，且與其預后不良有關，提示p57kip2可能是乳腺癌的一個腫瘤抑制基因[20-22]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，p57kip2蛋白在子宮內膜分泌期中表達最高，在子宮內膜癌中表達較低，在增生性病變中表達最低，推測p57kip2蛋白在子宮內膜不同病變組織中的表達與在其他組織中的表達不同，可能與雌、孕激素調控有關。本實驗結果顯示，E2干擾JEC細胞后，隨著時間的延長和藥物濃度的提高，p57kip2蛋白的表達呈遞增趨勢，提示雌激素可上調p57kip2在EC中的表達，且有時間和濃度依賴性。

本實驗WB結果顯示，E2作用JEC細胞24h后，細胞中p57kip2蛋白的表達較對照組降低，可能由于存在轉錄后修飾途徑，如磷酸化和泛素化，使p57kip2蛋白表達降低，也可能是存在microRNAs通過誘導靶mRNA降解和抑制靶mRNA翻譯，以降低p57kip2蛋白的表達；隨著E2干擾時間的延長、藥物濃度的增高，JEC細胞中ERβ、p57kip2蛋白的表達均逐漸升高，推測在雌激素作用下，ERβ蛋白在EC中的表達增高，可能誘導p57kip2蛋白表達增高，使細胞無法從G1期轉變到S期，從而抑制細胞進一步惡性增殖。

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[收稿2016-06-08;修回2016-07-06]

(編輯：王福軍)

Effects of estrogen on the expressions of ERα, ERβ and P57kip2in JEC cells of human endometrial carcinoma

LiuMengmeng1，SunXiaojie1，ZhouZhengping2，XiaoXin2，YuanDan1

(1.Department of Pathology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；2.Electron Microscope Laboratory of Medicine and Biology Research Center, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate the effects of estrogen on the expressions of estrogen receptor subtype (ERα, ERβ) and p57kip2in human endometrioid carcinoma cells named JEC.Methods The JEC cells cultured in vitro were treated with different concentrations (10-6mol/L,10-8mol/L,10-10mol/L) of β-Estradiol (E2); Another group of JEC cells was cultured without E2, as control group.After 24, 48, 72 h, the morphological changes of JEC cells were observed by light microscopy and electron microscopy.The growth of cells was detected by MTT assay.And, the expression of ERα、ERβ、and p57kip2protein was analyzed by Western Blot (WB) assay.Results The middle and low concentration of E2could promote the growth of JEC cells (P<0.05), Conversely, high concentration of E2could inhibit the growth of JEC cells, even the difference was not statistically significant (P>0.05); Compared with the control group, the microvilli and cytoplasmic secretory vesicles of JEC cells in low concentration group were decreased, While in high concentration group, microvilli and cytoplasmic secretory vesicles of JEC cells were increased.Furthermore, ERβ, but not ERα, was expressed weakly in experimental group or control group.With the increase of the concentration of E2and the extension of the time, the expression of ERβ and p57kip2protein showed an increasing trend (P<0.05).Conclusion The expression of ERα in JEC cells may be missing.With the increase of the concentration of estrogen and the extension of time, the expression of ERβ and p57kip2in EC are all up-regulated.The middle and low concentration of estrogen could promote the proliferation of JEC cells.

endometrial carcinoma; estrogen; ERα; ERβ; p57kip2

貴州省社發(fā)攻關項目(NO：黔科合SY字[2013]3011)。

周正平，女，教授，碩士生導師，研究方向：婦科腫瘤， E-mail:zhouzp66@163.com。

R737.33

A

1000-2715(2016)04-0397-06