劉富兵，尹　力，徐　珊，張　超，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 研究生院，貴州 遵義　563099；2.貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

異氟醚對(duì)老年大鼠腦皮層和海馬神經(jīng)元凋亡的影響*

劉富兵1，尹力2，徐珊2，張超2，朱昭瓊2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 研究生院，貴州 遵義563099；2.貴州省麻醉與器官保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

目的 檢測(cè)老年大鼠吸入異氟醚后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬不同腦區(qū)神經(jīng)元凋亡的程度，分析異氟醚的致神經(jīng)元凋亡作用是否隨腦區(qū)變化。方法 36只健康SD大鼠，雄性，體重300～400 g，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、氧氣組、蘇醒后2 h組、蘇醒后1 d組、蘇醒后3 d組、蘇醒后7 d組，每組6只。除空白對(duì)照組和氧氣組外，余各組大鼠吸入2%異氟醚30 min。利用Morris水迷宮記錄分析系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的行為改變， TUNEL技術(shù)觀察海馬內(nèi)皮層、CA1和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果 蘇醒后2 h組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，而同組大鼠海馬的皮層、 CA1和CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平均無明顯差異。與其它組相比，氧氣組大鼠海馬的 CA1和CA3區(qū)細(xì)胞凋亡水平略微升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 異氟醚導(dǎo)致的海馬不同腦區(qū)神經(jīng)元凋亡與其誘發(fā)的老年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降無明顯相關(guān)性。

異氟醚；神經(jīng)元凋亡；海馬；認(rèn)知功能障礙；老年大鼠

臨床常用吸入麻醉藥異氟醚可能誘發(fā)老年人術(shù)后出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。(Postoperative Cognitive Dysfunction，POCD)[1-3]。有研究顯示，異氟醚可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡[4-6]，并推測(cè)這一神經(jīng)毒性作用與老年病人異氟醚麻醉后的POCD相關(guān)。然而，目前罕有研究關(guān)注異氟醚麻醉對(duì)老年期大腦各腦區(qū)神經(jīng)元凋亡的敏感性差異，故本研究檢測(cè)異氟醚麻醉后不同時(shí)間點(diǎn)老年大鼠皮層和海馬各區(qū)神經(jīng)元凋亡的情況，從而分析異氟醚的致神經(jīng)元凋亡作用與各腦區(qū)的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1一般資料動(dòng)物為SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，鼠齡15月，體重300～400 g。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：scxk渝2007-0005)。

1.2試劑與儀器異氟醚(山東魯南制藥集團(tuán)，批號(hào)100401)，TUNEL試劑盒(上海羅氏制藥有限公司)；DAB顯色試劑盒(武漢BOSTER公司)；PBS(武漢BOSTER公司)。

Morris水迷宮系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號(hào)MT-200)；麻醉機(jī)(上海德爾格醫(yī)療設(shè)備有限公司，Drager Julian)和氣體監(jiān)測(cè)儀(上海德爾格醫(yī)療設(shè)備有限公司)；細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司，DMLB2HC)；切片機(jī)(德國Leica公司，RM2230)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組及給藥方法空白對(duì)照組(Control，n=6)：空氣環(huán)境中自由活動(dòng)30 min;氧氣組(O2，n = 6)：密封麻醉盒內(nèi)吸純氧30 min；蘇醒后2 h組(T1，n=6)、蘇醒后1 d組(T2，n=6)、蘇醒后3 d組(T3，n=6)和蘇醒后7 d組(T4，n=6)均于密封麻醉盒吸入2%異氟醚30 min。

1.3.2Morris水迷宮模型建立大鼠Morris水迷宮為一直徑120 cm，高60 cm的圓形水池，將水池分為4個(gè)象限，在任一象限放入平臺(tái)，平臺(tái)直徑15 cm，高30 cm，加水并使水面高過平臺(tái)2～3 cm，放入奶粉500 g并攪勻使水面呈乳白色，以遮蔽平臺(tái)，消除大鼠視覺提示。實(shí)驗(yàn)過程中保持安靜，減少聲音及光源刺激。

定位航行訓(xùn)練(Place Navigation Test，PNT )[7]每日10∶00訓(xùn)練，每天4次，共5 d。將大鼠頭朝池壁從東、南、西、北4個(gè)入水點(diǎn)分次放入水池中，記錄大鼠自入水至四肢爬上平臺(tái)所需的時(shí)間以及游泳的總路程，即逃避潛伏期(s)和總路程(cm)。實(shí)驗(yàn)要求：大鼠爬上平臺(tái)停留5 s算合格，否則當(dāng)作未爬上平臺(tái)處理；入水后120 s內(nèi)仍未找到平臺(tái)，系統(tǒng)采集時(shí)間記錄潛伏期為120 s，人為將未找到平臺(tái)的大鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上休息30 s后繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。游泳總路程：選擇不同位置將大鼠放入水池，記錄大鼠入水后至成功爬上平臺(tái)期的游泳距離。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在平臺(tái)停留5 s視為登陸成功；大鼠入水120 s后仍未找到平臺(tái)則終止實(shí)驗(yàn)，該鼠逃避潛伏期記120 s。

1.3.3TUNEL法檢測(cè)各腦區(qū)神經(jīng)元凋亡大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄結(jié)束后腹腔給予7%水合氯醛麻醉，開胸后，剪開右心耳，左心室插管，灌注500 mL生理鹽水+4%多聚甲醛后取腦，置于10%多聚甲醛中固定36 h。固定好的腦組織常規(guī)制作33 μm石蠟切片。石蠟切片經(jīng)新鮮配制0.01 mol/L PBS沖洗、Proteinase K 50 μL (Tris·HCl pH7.8稀釋) 37 ℃消化13 min、恢復(fù)室溫后加入65 μl雙氧水10 min、滴加50 μL TUNEL混合劑，37 ℃孵育80 min；滴加50 μL COUNTER- POD，37 ℃孵育30 min、DBA顯色劑60 μL顯色30 s、最后蘇木素復(fù)染1 min，脫水，封片。細(xì)胞計(jì)數(shù)過程：低倍鏡(10×10)下定位海馬皮層、CA1和CA3區(qū)，高倍鏡(40×10)下選取6個(gè)非重疊視野，每個(gè)視野下使用Image-ProplusJ軟件拍攝照片并計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，以6個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均值作為每只大鼠所選腦區(qū)的細(xì)胞凋亡水平。

2　結(jié)果

2.1Morris水迷宮定位航行總路程Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在各時(shí)間組中，只有麻醉蘇醒后2 h的大鼠組的定位航行實(shí)驗(yàn)總路程出現(xiàn)了明顯增多(P<0.05，見圖1)，提示吸入2%異氟醚30 min可使老年大鼠在短期內(nèi)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，但會(huì)恢復(fù)。

與Control組比較， *P<0.05；與O2、T3、T4組比較，#P<0.05?！　D1　吸入異氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)總路程

2.2各組大鼠海馬CA1、CA3及皮層區(qū)的細(xì)胞凋亡水平如圖2所示，凋亡的神經(jīng)元表現(xiàn)為體積縮小、細(xì)胞核固化并呈棕黃色，細(xì)胞膜下游染色質(zhì)塊聚集，某些凋亡細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體，胞質(zhì)分割成塊狀(凋亡小體)，無完整細(xì)胞骨架。

圖2　吸入異氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬不同腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡情況 (×400)

單因素方差分析，T1-T4組大鼠海馬CA1、CA3及皮層區(qū)的神經(jīng)元凋亡水平無明顯差異(P>0.05)，與對(duì)照組和T1-T4組相比，氧氣組大鼠海馬的 CA1和CA3區(qū)細(xì)胞凋亡水平升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

分區(qū)ControlO2T1T2T3T4CA16.92±2.937.17±2.666.58±1.515.75±2.016.33±1.926.08±2.71CA37.67±2.878.42±2.117.00±2.136.25±3.057.75±2.495.83±2.79Cor 9.42±2.718.58±2.889.08±3.157.92±3.508.08±3.427.75±3.17

3　討論

本實(shí)驗(yàn)首次將老年大鼠海馬和皮層兩個(gè)不同腦區(qū)的神經(jīng)元凋亡作為觀察指標(biāo)，開展探索異氟醚導(dǎo)致老年個(gè)體學(xué)習(xí)記憶功能下降的機(jī)制。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分,現(xiàn)已證明海馬主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)、記憶、情緒等重要的中樞神經(jīng)功能[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，損傷動(dòng)物海馬會(huì)導(dǎo)致短時(shí)記憶儲(chǔ)存能力喪失，而不影響已經(jīng)形成的記憶，即長時(shí)記憶。這說明海馬主要負(fù)責(zé)記憶的獲取和暫時(shí)儲(chǔ)存[10-11]。從解剖上來看，海馬可被分為CA1-4個(gè)區(qū)域，各區(qū)域間的神經(jīng)元發(fā)育和纖維排列存在明顯的區(qū)別。在4個(gè)區(qū)域中，CA1和CA3區(qū)是面積最大的區(qū)域，并且研究已證實(shí)這兩個(gè)區(qū)域是海馬內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)回路形成的主要區(qū)域[12]。此外，皮層區(qū)是哺乳動(dòng)物的最高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)，其內(nèi)神經(jīng)元主要是發(fā)育完善的錐形神經(jīng)元，主要參與意識(shí)形成、思維整合等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，其在學(xué)習(xí)記憶行為中主要負(fù)責(zé)編碼和存儲(chǔ)長時(shí)陳述性記憶[13]。我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)新生期大鼠重復(fù)吸入亞麻醉濃度的七氟醚會(huì)損害大鼠成年期學(xué)習(xí)記憶能力，而對(duì)短時(shí)記憶能力無影響[14]。鑒于以上原因，本實(shí)驗(yàn)將大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的兩個(gè)腦區(qū)納入研究范圍，以期證明吸入異氟醚在這兩個(gè)腦區(qū)引起的神經(jīng)元凋亡是否與一過性學(xué)習(xí)記憶能力下降有關(guān)。

從水迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，老年大鼠吸入2%異氟醚30 min只是在蘇醒后2 h出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能損害，至蘇醒后1 d及以后就基本恢復(fù)正常。而之后的神經(jīng)元凋亡檢測(cè)卻顯示，學(xué)習(xí)記憶能力受損的T2組大鼠腦皮層和海馬CA1、CA3區(qū)域神經(jīng)元凋亡情況與其他時(shí)間組大鼠相比并無明顯差異。提示異氟醚在大鼠的腦皮層和海馬CA1、CA3區(qū)域引起的神經(jīng)元凋亡并不是老年大鼠出現(xiàn)一過性學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老年大鼠在吸入2%異氟醚30 min后2 h內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一過性的學(xué)習(xí)記憶能力下降。此外，吸入異氟醚誘導(dǎo)的大鼠腦皮層和海馬CA1、CA3區(qū)域的神經(jīng)元凋亡與學(xué)習(xí)記憶能力下降無明顯相關(guān)。

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[收稿2016-06-23;修回2016-07-21]

(編輯：王靜)

The effects of isoflurane on neuron apoptosis of cerebral cortex and hippocampus in old rats

LiuFubing1,YinLi2,XuShang2,ZhangChao2,ZhuZhaoqiong2

(1.Graduate School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099 China)

Objective To observe the neuron apoptosis in the hippocampus and cerebral cortex of old rats at different time points after inhalation of isoflurane, and explore the apoptosis effect of isoflurane on different brain area.Methods Healthy old male Sprague Dawley rats (n=36) were randomly divided into control group, oxygen group, 2 hours after recovery group, 1 day after recovery group, 3 days after recovery group and 7 days after recovery group respectively. Morris water maze were used to explore the ethological effects of 30 min inhalation of isoflurane, while TUNEL were used to detect the expression of apoptosis in the hippocampus (CA1, CA3)and cerebral cortex.Results The inhalation of isoflurane inhibited the learning and memory ability of rats at 2 hours after recovery. But there is no difference on apoptosis expression in CA1, CA3 and cerebral cortex at corresponding time points. The variations of apoptosis in all groups were not regularly, the apoptosis in oxygen group is higher then other groups in area CA1, CA3, but the difference has no significance.Conclusion The neuron apoptosis in the hippocampus and cerebral cortex caused by inhalation of 2% isoflurane for 30 min has not obviously impact on the learning and memory ability of old rats.

isoflurane; neuron apoptosis; hippocampus; postoperative cognition;old rats

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360180)；貴州省科技廳聯(lián)合資金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2012]04)。

朱昭瓊，女，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：吸入麻醉,E-mail:ganzhuzhaoqiong@sina.com。

R338

A

1000-2715(2016)04-0375-03