邱成楷，余守洋，蔣奇陽(yáng)，姚東劼，葉維坤，涂　平，白威峰，羅素元

(遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

左旋延胡索乙素對(duì)嗎啡條件性位置偏愛大鼠伏核NR1蛋白表達(dá)的影響*

邱成楷，余守洋，蔣奇陽(yáng)，姚東劼，葉維坤，涂平，白威峰，羅素元

(遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義563099)

目的 研究左旋延胡索乙素(l-tetrahydropalmatine，l-THP)對(duì)嗎啡誘發(fā)條件性位置偏愛 (conditioned place preference, CPP)大鼠伏核(nucleus accumbens，NAc)中N-甲基-D-天冬氨酸受體NR1亞基(NR1)表達(dá)改變的影響。方法 大鼠隨機(jī)分組，即正常對(duì)照組、模型CPP組、生理鹽水治療組及l(fā)-THP低(0.94 mg/kg)、中(1.88 mg/kg)和高(3.76 mg/kg)治療組。正常對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水外，剩余各組大鼠采用頸背部皮下劑量遞增法注射嗎啡(起始劑量10 mg/kg，每天遞增10 mg/kg，至注射10 d時(shí)為100 mg/kg)，經(jīng) CPP訓(xùn)練10 d，末次訓(xùn)練后48 h進(jìn)行 CPP檢測(cè)確認(rèn)CPP模型成功。各治療組大鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)治療6 d后進(jìn)行CPP檢測(cè)，之后處死大鼠并采用腦立體定位儀取大鼠NAc腦組織，利用Western Blot方法檢測(cè)NR1基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)CCP檢測(cè)，模型組大鼠在白箱(嗎啡伴藥箱)停留時(shí)間，與生理鹽水組比較明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，而經(jīng)l-THP 1.88和3.76 mg/kg 治療后，停留時(shí)間恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。Western Blot檢測(cè)到CPP大鼠NAc核團(tuán)NR1的蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，l-THP 1.88和3.76 mg/kg治療后，NR1蛋白表達(dá)被逆轉(zhuǎn)。結(jié)論 在大鼠嗎啡精神依賴過(guò)程中l(wèi)-THP可顯著抑制NAc核團(tuán)中NR1蛋白表達(dá)的增加，這一作用可能是l-THP加速大鼠嗎啡CPP效應(yīng)消退的機(jī)制之一。

左旋延胡索乙素；條件性位置偏愛；嗎啡；精神依賴；NR1；大鼠

在戒毒領(lǐng)域，消除毒品導(dǎo)致的精神依賴以降低復(fù)吸率是治療戒毒的核心問(wèn)題，阿片類物質(zhì)成癮導(dǎo)致的精神依賴則是復(fù)吸的一個(gè)重要因素，故尋找對(duì)其有效治療的藥物非常緊迫。在阿片類物質(zhì)成癮過(guò)程中，阿片類精神依賴的形成和維持主要是大腦神經(jīng)獎(jiǎng)賞環(huán)路引起的獎(jiǎng)賞效應(yīng)[1]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)曾發(fā)現(xiàn)，NR1亞基在嗎啡精神依賴大鼠伏核(NAc)(系腦獎(jiǎng)賞環(huán)路的核團(tuán)之一)中表達(dá)量增加[2]，提示精神依賴可能與嗎啡引起NR1亞基的表達(dá)變化有關(guān)。另外，之前的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)[3]，左旋延胡索乙素(l-THP)可以衰減大鼠條件性位置偏愛(CPP)效應(yīng)，且可逆轉(zhuǎn)大鼠獎(jiǎng)賞環(huán)路多個(gè)核團(tuán)中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體NR2B亞基的上調(diào)，并認(rèn)為這可能是l-THP發(fā)揮戒毒作用的藥理學(xué)機(jī)制之一[4-5]。那么，l-THP是否也可以逆轉(zhuǎn)NR1的異常表達(dá)則有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察l-THP對(duì)大鼠嗎啡CPP效應(yīng)的消退作用以及對(duì)NAc核團(tuán)中NR1蛋白表達(dá)水平的影響，探討l-THP取消CPP效應(yīng)與NR1蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，為l-THP治療阿片類精神依賴提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡健康雄性SD大鼠，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK渝2012-0005)，實(shí)驗(yàn)前將大鼠放置動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物房通風(fēng)良好，恒溫24 ℃，光照周期8∶00-20∶00，大鼠自由進(jìn)食飲水。

1.1.2試劑與藥品鹽酸嗎啡注射液，批號(hào)：TD2006-0028，購(gòu)自沈陽(yáng)第一制藥廠；l-THP由廣西中醫(yī)藥研究所提供；兔NR1受體一抗購(gòu)自美國(guó)BD公司；山羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器條件性位置偏愛(CPP)實(shí)驗(yàn)箱參照文獻(xiàn)[6]制作，箱體長(zhǎng)、高和寬分別為600、300和300 mm，制成大小相同的黑白2個(gè)箱子，黑箱底部粗糙、白箱底部光滑。黑白箱之間有1個(gè)可以限制大鼠自由穿梭的隔板(高250 mm)，抽取隔板大鼠可以在黑白箱之間自由穿梭，CPP實(shí)驗(yàn)視頻跟蹤計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析系統(tǒng)由上海吉量軟件科技有限公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建立嗎啡CPP模型、分組及給藥大鼠分批放置于CPP條件箱(黑白箱)中任其自由穿梭，連續(xù)3 d，1次/d，15 min/次，第3 天記錄大鼠在黑、白箱中停留的時(shí)間，剔除對(duì)黑箱或白箱有明顯偏愛的大鼠，再根據(jù)大鼠喜黑厭白的天然特性，確定黑箱為天然偏愛箱，白箱作為嗎啡伴藥箱。最后將篩選合格的60只大鼠隨機(jī)分為6組(每組10只)；即正常對(duì)照組(NS組，皮下注射生理鹽水)、嗎啡模型組(CPP)、生理鹽水治療組、l-THP高劑量(3.76 mg/kg)、中劑量(1.88 mg/kg)和低劑量(0.94 mg/kg)治療組。

模型建立：?jiǎn)岱饶Ｐ徒M每天上午劑量遞增法頸部皮下注射嗎啡，第1天為10 mg/kg，逐日遞增10 mg/kg，至第10 天為100 mg/kg，每天注射嗎啡后20 min將大鼠置白箱進(jìn)行CPP訓(xùn)練40 min；下午注射生理鹽水后按上述方法將大鼠放置黑箱訓(xùn)練，持續(xù)10 d。各組大鼠在末次訓(xùn)練48 h后經(jīng)CPP檢測(cè)，在白箱子中停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，確認(rèn)大鼠CPP模型成功。

模型大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)治療6 d，經(jīng)CPP測(cè)試后戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠。各組處死大鼠，參照腦立體定位圖譜取其NAc核團(tuán)[7]，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)其NR1蛋白的表達(dá)。

1.2.2Western Blot檢測(cè)NR1受體將所收集的大鼠伏核組織進(jìn)行稱重，置4 ℃預(yù)冷裂解緩沖液中勻漿，離心(12 000 rpm/min)后轉(zhuǎn)移取上清至離心管中。根據(jù)BCA蛋白試劑盒說(shuō)明檢測(cè)NR1蛋白濃度。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳分離蛋白，100 V電泳約2 h，100 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶封閉1 h后，兔抗NR1一抗(1∶2 000) 孵育4 ℃過(guò)夜。次日，復(fù)溫1 h后TBST 洗3次，每次10 min；山羊抗兔二抗(1∶1 500)孵育1 h后，再次TBST洗3次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光試劑Pico Chemiluminescent Substrate A、B液各1 mL, 混勻，均勻滴加于PVDF膜上，閉光孵育3 min，將膜放置于一干凈透明的塑料薄膜中，用柯達(dá)膠片曝光。曝光后的膠片用掃描儀掃描后，以β-actin為內(nèi)參，利用Image-J軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算。

2　結(jié)果

2.1CPP效應(yīng)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)CPP檢測(cè)正常對(duì)照組大鼠訓(xùn)練前后在白箱停留時(shí)間無(wú)顯著差異，而CPP模型組大鼠訓(xùn)練后較訓(xùn)練前在白箱停留時(shí)間明顯增加(P<0.01)。經(jīng)l-THP治療6 d后，與生理鹽水治療組比較，延胡索乙素1.88和3.76 mg/kg組大鼠在白箱的停留時(shí)間明顯縮短(P<0.01，見表1和圖1)。

組別大鼠在白箱停留時(shí)間(s)訓(xùn)練前訓(xùn)練后治療6d后正常對(duì)照組383±62401±76 —模型組407±83528±40ab—生理鹽水治療組386±75527±55ab524±79延胡索乙素低劑量組396±81523±32ab519±47延胡索乙素中劑量組389±95528±42ab386±76c延胡索乙素高劑量組399±65536±67ab386±88c

a：訓(xùn)練前后各組比較，P<0.01；b：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；c：與生理鹽水治療組比較，P<0.01。

圖1　各組大鼠訓(xùn)練前后在白箱中停留時(shí)間

2.2各組大鼠NAc腦區(qū)中NR1 蛋白的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，嗎啡模型組大鼠NAc核團(tuán)中NR1蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)，與NS治療組比較，l-THP 1.88和3.76 mg/kg組大鼠治療6 d，NAc腦區(qū)NR1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(見圖2A、B)。

1.正常對(duì)照組；2.模型組；3.生理鹽水治療組；4.延胡索乙素低劑量組；5.延胡索乙素中劑量組；6.延胡索乙素高劑量組。a：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；b：與生理鹽水治療組比較，P<0.01。圖2　各組大鼠訓(xùn)練前后及治療后NAc腦區(qū)NR1蛋白的表達(dá)

3　討論

在藥物成癮研究中，CPP實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[8-10]主要是用來(lái)判別藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)和精神依賴性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗎啡戒斷后CPP模型組大鼠在白箱停留時(shí)間明顯增加，說(shuō)明大鼠對(duì)嗎啡產(chǎn)生了精神依賴。與生理鹽水治療組比較，l-THP 1.88和3.76 mg/kg治療6 d，大鼠在白箱停留時(shí)間顯著縮短，表明l-THP的治療可促進(jìn)嗎啡CPP效應(yīng)的消退，即l-THP對(duì)嗎啡精神依賴具有治療作用[5]。模型大鼠NR1的蛋白表達(dá)在NAc腦區(qū)顯著增加，經(jīng)l-THP 1.88和3.76 mg/kg治療后，大鼠NR1的表達(dá)量顯著降低，提示NAc腦區(qū)中NR1表達(dá)的上調(diào)可能參與了嗎啡精神依賴的形成。經(jīng)過(guò)l-THP治療后，NR1的表達(dá)恢復(fù)到正常水平，表明l-THP通過(guò)抑制NAc腦區(qū)中NR1的表達(dá)是其加速衰減CPP效應(yīng)的又一藥理作用機(jī)制。

以往研究證實(shí)NMDA受體參與神經(jīng)系統(tǒng)獎(jiǎng)賞效應(yīng)及突觸可塑性，而且還認(rèn)為NMDA受體的NR2B是介導(dǎo)調(diào)控阿片類藥物精神依賴的一個(gè)重要亞基，嗎啡藥物成癮模型中，獎(jiǎng)賞環(huán)路和學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)腦區(qū)中的NR2B的表達(dá)都會(huì)發(fā)生改變[11]。本課題組及其他團(tuán)隊(duì)近期研究發(fā)現(xiàn)[2]，NMDA受體的NR1亞基在精神依賴條件下的NAc核團(tuán)中表達(dá)顯著增加，表明NR1在阿片類藥物精神依賴的形成和維持過(guò)程中也具有重要作用，因而NR1也可成為治療阿片類藥物成癮的潛在靶點(diǎn)。NR1做為NMDA的必需功能亞基，可能在NR2B的協(xié)同作用下介導(dǎo)阿片類精神依賴，其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，促進(jìn)DA釋放增加、腦內(nèi)多巴胺獎(jiǎng)賞系統(tǒng)活性增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)阿片類藥物精神依賴的形成和維持起著重要的作用。l-THP是一種植物源性鈣拮抗劑[12-14]，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)嗎啡CPP效應(yīng)的消退[15]。除此之外，l-THP是否還有其它作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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[收稿2016-05-10;修回2016-06-28]

(編輯：王靜)

The effect ofl-tetrahydropalmatine on NR1 protein expression of NAc in morphine-induced Conditioned Place Preference rats

QiuChengkai,YuShouyang,JiangQiyang,YaoDongjie,YeWeikun,TuPing,BaiWeifeng,LuoSuyuan

(Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To observe the change on expression of the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit (NR1) in nucleus accumbens (NAc) of the morphine induced Conditioned Place Preference (CPP) rat after the treatment withl-tetrahydropalmatine (l-THP). Methods Sixty rats were randomly divided into normal NS group,morphine induced Conditionned Place Preference (CPP) model group, normal NS treatment group and three dosages ofl-THP treatment groups. The rats were trained in black compartments and white ones (drug-paired compartment) with the increasing doses of morphine for 10 days (hypodermically injected from 10 to 100 mg/kg). Models of CPP were validated in those psychological dependence rats after 48 h training. The high, medium and low dosage group ofl-THP were givenl-THP 0.76, 1.88 and 0.94 mg/kg lavage treatment, respectively. NS treatment group were lavaged normal saline for 6 days and they were killed after test of CPP. Western blotting detected the expression changes of NR1 protein.Results Compared with NS control group, the residence time in the white box (morphine pair box) of CPP model group rats was significantly longer (P<0.01). After the treatment ofl-THP (3.76, 1.88 and 0.94 mg/kg), residence time return to that of normal saline control group. Compared with the NS control group, the expression levels of NR1 was increased in NAc in CPP group, but NR1 ofl-THP (3.76 and 1.88 mg/kg) reduced in NAc (P< 0.01). Conclusion Thel-THP could reverse the NR1 protein expression in NAc of the morphine psychological dependence rats, might be the potential mechanism of pharmacological effects which should accelerate the fading process of morphine CPP effects in the experimented bodies.

l-tetrahydropalmatine (l-THP); CPP; morphine; psychological dependence; NR1; rat

貴州省科技廳社會(huì)攻關(guān)項(xiàng)目(NO：黔科合SY字[2013]3065)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F586)；貴州省2013年度聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2013]22)。

羅素元，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，E-mail:swx_100@163.com。

R966

A

1000-2715(2016)04-0358-04