徐毓琴，戴茜茜，唐慧琴，谷笑笑，潘康成,2,

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

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產(chǎn)γ-氨基丁酸益生菌的篩選及其生物活性研究

徐毓琴1，戴茜茜1，唐慧琴1，谷笑笑1，潘康成1,2,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

為篩選具有生物拮抗活性和耐酸耐膽鹽能力的高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)的菌株，首先從待分離樣品中篩選出可疑菌株，然后利用紙層析和HPLC-MS進(jìn)行定性和定量分析，篩選出高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株。通過(guò)細(xì)菌形態(tài)、生理生化特性并結(jié)合細(xì)菌16S rDNA序列對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究高產(chǎn)菌株對(duì)3株動(dòng)物性病原菌的生物拮抗作用及其耐酸耐膽鹽試驗(yàn)。結(jié)果表明，從泡菜中篩選出的菌株GA8為高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株，在含有1% L-谷氨酸鈉的GYP培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48 h，產(chǎn)GABA量達(dá)3.50 g·L-1，經(jīng)鑒定該菌株為植物乳桿菌；該菌株全菌液和上清液對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌、雞源大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，其菌體懸液無(wú)抑菌能力；該菌初始活菌數(shù)為108cfu·mL-1時(shí)，在pH 2.0的酸性環(huán)境中處理4 h后，活菌數(shù)能達(dá)到106cfu·mL-1以上；0.3%膽鹽處理4 h，活菌數(shù)達(dá)到103cfu·mL-1左右。表明所篩選出的產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株GA8具有一定的抑菌性能和耐酸能力，但耐膽鹽能力不強(qiáng)。

益生菌；γ-氨基丁酸；生物拮抗；耐酸耐膽鹽

γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，在谷氨酸脫羧酶催化下，由谷氨酸脫羧形成[1]，具有鎮(zhèn)靜安神、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、抗疲勞、改善腦機(jī)能等多種生理功能，能參與體內(nèi)多種代謝活動(dòng)。Ali等[2]研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠口服γ-氨基丁酸，可以改善順鉑引起的大鼠腎毒性副作用，而且不影響順鉑的治療效果。乳酸菌[3]、酵母菌[4]、紅曲霉菌[5]等都能利用自身合成的谷氨酸脫羧酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化成GABA，并普遍應(yīng)用于食品、藥品加工行業(yè)中，以提高人類(lèi)的免疫能力，起到保健的作用。Ratanaburee等[6-7]將產(chǎn)GABA乳酸菌應(yīng)用于食品和飲料中以改善口感，增強(qiáng)體質(zhì)。Diana等[8]在西班牙奶酪中分離出產(chǎn)GABA的乳酸菌，發(fā)現(xiàn)該菌有調(diào)節(jié)血壓的作用。穆琳[9]在酸奶中添加GABA乳酸菌，提高了酸奶的發(fā)酵工藝與品質(zhì)。

由于抗生素的大量使用，耐藥性、藥物殘留及環(huán)境污染等問(wèn)題顯現(xiàn)出來(lái)，所以開(kāi)發(fā)出替代抗生素的新型產(chǎn)品迫在眉睫，而益生菌作為功能性食品成為新的研究熱點(diǎn)。產(chǎn)γ-氨基丁酸益生菌優(yōu)化與發(fā)酵方面的研究已經(jīng)非常廣泛，但有關(guān)產(chǎn)γ-氨基丁酸益生菌生物拮抗作用及耐酸耐膽鹽方面的研究卻相對(duì)較少，本試驗(yàn)旨在篩選出產(chǎn)γ-氨基丁酸益生菌并探討其抑菌效果及耐酸耐膽鹽能力。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

土壤和糞便采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，泡菜、酸奶、豆豉購(gòu)自四川省雅安市吉選超市。雞白痢沙門(mén)氏菌CVCC533購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，雞源大腸桿菌和金黃色葡萄球菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(SIGMA)，豬膽鹽(北京奧博星生物技術(shù)公司)，L-谷氨酸鈉和茚三酮(成都科龍化工試劑廠。電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(SIGMA)，液相色譜質(zhì)譜連用儀(AGILENT)，PCR儀(BIO-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

營(yíng)養(yǎng)肉湯：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 L，pH 7.2，1×105Pa高壓滅菌15～20 min。如制備營(yíng)養(yǎng)瓊脂，在上述成分中加入1.8%的瓊脂粉。

GYP種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、酵母粉10 g、蛋白胨5 g、醋酸鈉2 g、硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.001 g、硫酸亞鐵0.001 g、氯化鈉0.001 g、蒸餾水1 L，pH 6.8，1×105Pa高壓滅菌15 ～ 20 min。

GYP發(fā)酵培養(yǎng)基：GYP種子培養(yǎng)基中添加1%的L-谷氨酸鈉，pH 6.8，1×105Pa高壓滅菌15 ～ 20 min。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化

分別稱(chēng)取10 g土壤、泡菜、酸奶、豆豉及糞便樣品，加入帶玻璃珠的90 mL滅菌生理鹽水三角瓶中，37℃ 200 r·min-1振蕩1 h，無(wú)菌操作進(jìn)行10倍遞進(jìn)稀釋?zhuān)舛?0-4和10-5稀釋液0.1 mL分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，分別37℃恒溫需氧或厭氧培養(yǎng)2 d。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，將革蘭氏染色陽(yáng)性菌進(jìn)行反復(fù)劃線純化后，接種于斜面培養(yǎng)基中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2產(chǎn)GABA菌株的初步篩選

將得到的菌株接種于100 mL GYP種子培養(yǎng)基中，30℃靜置或振蕩培養(yǎng)1 d，然后以5%的接種量接入100 mL GYP發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃靜置或振蕩培養(yǎng)2 d，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行GABA定性和相對(duì)定量分析。

定性分析：采用紙層析法進(jìn)行測(cè)定，展開(kāi)劑(正丁醇∶冰醋酸∶水體積比為4∶1∶3)中含有4 g·L-1的茚三酮溶液便于顯色。取發(fā)酵上清液0.5 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，以5 g·L-1GABA標(biāo)準(zhǔn)樣品作為對(duì)照，當(dāng)展開(kāi)劑距層析紙前沿1 cm時(shí)，將層析紙放于70℃烘箱中顯色5 min，觀察是否有GABA斑點(diǎn)。

相對(duì)定量分析：將GABA標(biāo)準(zhǔn)品配成0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90，1.00 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和上述待測(cè)發(fā)酵液進(jìn)行點(diǎn)樣、展層等同定性分析，將標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)樣品一致的斑點(diǎn)剪下，洗脫，洗脫液在分光光度計(jì)波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸光值。繪制GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出回歸曲線，將待測(cè)樣品的吸光值帶入公式，求出待測(cè)樣品的GABA含量。

1.2.3發(fā)酵液中GABA的精確定量分析

采用HPLC-MS法對(duì)上述獲得相對(duì)高產(chǎn)的產(chǎn)GABA菌株發(fā)酵液進(jìn)行精確的定量分析，用50 g·L-1三氯乙酸稀釋上述相對(duì)高產(chǎn)菌株培養(yǎng)48 h的上清液至適當(dāng)濃度，處理后的樣品送北京輝奧生物技術(shù)有限公司檢測(cè)GABA含量。

1.2.4高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株的初步鑒定

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[10]測(cè)定，對(duì)產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行菌落、細(xì)菌形態(tài)和生理生化特性鑒定。同時(shí)參照文獻(xiàn)[11]對(duì)分離菌株進(jìn)行需氧性試驗(yàn)。

1.2.5菌株的16S rDNA序列同源性分析

按照參考文獻(xiàn)[12]的方法提取細(xì)菌基因組DNA，采用16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，若出現(xiàn)1.5 kb左右的單一條帶，則證明已成功擴(kuò)增目標(biāo)16S rDNA序列。將PCR產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將得到的16S rDNA序列提交到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST在線對(duì)比，并在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取部分細(xì)菌16S rDNA序列，用MEGA 5.2軟件進(jìn)行多序列對(duì)比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定菌株的進(jìn)化分類(lèi)地位。

1.2.6高產(chǎn)GABA菌株對(duì)3株病原菌的生物拮抗試驗(yàn)

將篩選出的高產(chǎn)GABA菌株和3株病原菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，病原菌置于37℃，150 r·min-1水浴振蕩24 h，產(chǎn)GABA菌株置于37℃，30 r·min-1水浴振蕩24 h。用滅菌生理鹽水分別對(duì)3株病原菌進(jìn)行稀釋并調(diào)整菌液濃度為1×106cfu·mL-1。將高產(chǎn)GABA菌株培養(yǎng)物(全菌液)4 000 g離心10 min，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾后得無(wú)菌上清液；同時(shí)將菌體沉淀物用滅菌生理鹽水洗滌3次后重懸，調(diào)整菌體濃度為2×108cfu·mL-1，即為菌體懸液，然后參照文獻(xiàn)[13]，每組3個(gè)重復(fù)，用牛津杯法分別進(jìn)行全菌液、上清液和菌體重懸液對(duì)3株病原菌的生物拮抗試驗(yàn)。

1.2.7菌株的耐酸試驗(yàn)

取pH為2，3，4的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯各4.5 mL，分別接入0.5 mL的高產(chǎn)GABA菌株菌懸液(菌濃度為1×108cfu·mL-1)，37℃恒溫培養(yǎng)0，2和4 h，每組3個(gè)重復(fù)，采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌活菌數(shù)。

1.2.8菌株的耐膽鹽試驗(yàn)

取含豬膽鹽為0.1%，0.2%，0.3%和0.4%的滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯各4.5 mL，分別接入0.5 mL的高產(chǎn)GABA菌株菌懸液(菌濃度為1×108cfu·mL-1)，37℃恒溫培養(yǎng)0，2和4 h，每組3個(gè)重復(fù)，采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)菌活菌數(shù)。

1.2.9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)均用Excel進(jìn)行記錄、整理。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)GABA菌株的初步篩選

將分離純化得到的菌株制備菌種后，轉(zhuǎn)接于GYP發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃靜置或振蕩培養(yǎng)2 d后，采用紙層析對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行GABA的定性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離純化的所有菌株中，有16株產(chǎn)GABA(圖1)。將這16株GABA顯色的斑點(diǎn)，經(jīng)洗脫后，在波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸收值并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(y = 0.1238x + 0.1353，R2= 0.996 9，y表示吸光度，x表示GABA濃度)，計(jì)算γ-氨基丁酸的量，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，GA8號(hào)菌株產(chǎn)GABA量最高，產(chǎn)量為3.915 g·L-1。

2.2HPLC-MS法精確定量

挑選產(chǎn)GABA產(chǎn)量較高的的GA4，GA6，GA8，GA9和GA11號(hào)菌株，經(jīng)發(fā)酵后采用HPLC-MS法檢測(cè)分析，根據(jù)GABA標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(圖2-A)，發(fā)現(xiàn)樣品均在相同時(shí)間出現(xiàn)峰值(圖2-B)。GA4，GA6，GA8，GA9和GA11號(hào)菌株產(chǎn)GABA量分別為2.78，2.90，3.50，2.62和2.12 g·L-1，其中GA8號(hào)菌株產(chǎn)GABA量最高，檢測(cè)結(jié)果與初步篩選結(jié)果一致。

圖1　GABA紙層析定性檢測(cè)Fig.1　Qualitative detection of GABA by paper chromatography

表1不同菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸量的結(jié)果

Table 1The results of γ-Aminobutyric acid produced by different strains

菌株編號(hào)GABA量/(g·L-1)菌株編號(hào)GABA量/(g·L-1)GA11.138GA93.411GA21.130GA103.188GA32.622GA113.473GA43.210GA122.980GA53.125GA132.622GA63.600GA142.380GA73.107GA152.703GA83.915GA162.461

圖2　GABA標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)圖譜Fig.2　The HPLC-MS maps of GABA standard (A) and the sample (B)

2.3菌株的初步鑒定

將產(chǎn)量最高的GA8菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃需氧及厭氧培養(yǎng)48 h，細(xì)菌菌落為乳白色、針尖大小、圓形凸起、邊緣整齊、濕潤(rùn)，厭氧或兼性厭氧。革蘭氏染色為陽(yáng)性，顯微鏡下觀察為桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀。參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，菌株GA8的生理生化特征見(jiàn)表2。

2.4菌株的16S rRNA序列分析

以提取的菌株基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，得到一條長(zhǎng)度約1.5 kb的條帶，將其回收、測(cè)序，測(cè)得其序列長(zhǎng)度為1 449 bp。

表2菌株GA8的生理生化特征

Table 2Physiological and biochemical property of GA8 strain

項(xiàng)目GA植物乳桿菌a葡萄糖Glucose++乳糖Lactose++半乳糖Galactose++麥芽糖Maltose++蔗糖Sucrose++棉籽糖Raffinose++菊糖Synanthrin+NS鼠李糖Rhamnose--蜜二糖Melibiose++纖維二糖Cellobiose++果糖Fructose++水楊苷Salicin++山梨醇Sorbitol++甘露醇Mannitol++明膠Gelatin--吲哚Indole--接觸酶Catalase--硫化氫Hydrogensulfide--

注：a表示《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》上植物乳桿菌生理生化特征；“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性，NS為未檢測(cè)。

圖3　菌株GA8的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3　Phylogenetic tree of GA8 strain based on the 16S rDNA sequence

將得到的序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，前100個(gè)序列相似性均為99%，其中確切命名為植物乳桿菌的就有77條序列，同源性達(dá)到99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)顯示，菌株GA8的16S rRNA與已知的植物乳桿菌(Accession No.KJ779091)在一個(gè)分支上，相似性達(dá)100%。結(jié)合菌株GA8的菌落特征、細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特性與16S rRNA序列分析結(jié)果，確定菌株GA8為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

2.5菌株GA8對(duì)3株病原菌的生物拮抗作用

菌株GA8對(duì)3株病原菌的生物拮抗作用結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菌株GA8全菌液、上清液對(duì)雞白痢沙門(mén)氏菌、雞源大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，而菌體懸液對(duì)3株病原菌無(wú)抑制作用，表明菌株GA8對(duì)3株病原菌起抑制作用的不是細(xì)菌菌體而主要是上清液。

表3對(duì)致病菌的抑菌活性結(jié)果(Φ/mm)

Table 3The antibacterial activity against pathogenic bacteria (Φ/mm)

病原菌全菌液上清液菌體懸液雞白痢沙門(mén)氏菌16.10±0.2816.05±0.16—雞源大腸桿菌15.32±0.5011.48±0.20—金黃色葡萄球菌13.10±0.6613.10±0.32—

2.6耐酸試驗(yàn)結(jié)果

胃液pH為3左右，且食物通過(guò)胃的時(shí)間一般為1～2 h，因此乳酸菌作為益生菌應(yīng)該具有較好的耐酸性。從表4可以看出，菌株GA8初始活菌數(shù)為1.1×108cfu·mL-1，pH 2.0的環(huán)境中4 h后活菌數(shù)仍然在106cfu·mL-1以上，表明菌株GA8具有一定的耐酸性。

表4菌株GA8對(duì)酸的耐受性(lg cfu·mL-1)

Table 4The pH tolerance of strain GA8 (lg cfu·mL-1)

pH菌落數(shù)0h2h4h28.04±0.067.06±0.046.08±0.0738.04±0.068.10±0.128.61±0.0348.04±0.068.38±0.048.66±0.04

2.7菌株GA8耐豬膽鹽試驗(yàn)

菌株通過(guò)胃液后會(huì)在小腸中遇到膽鹽，故菌株要有足夠的耐膽鹽能力才能在腸道內(nèi)發(fā)揮作用。由表5可知，菌株GA8初始活菌數(shù)為1.1×108cfu·mL-1，0.1%膽鹽處理4 h活菌數(shù)能達(dá)到6.0×107cfu·mL-1以上，0.3%膽鹽處理4 h活菌數(shù)只能達(dá)到103cfu·mL-1左右，而0.4%膽鹽處理2 h后活菌數(shù)為0 cfu·mL-1，表明菌株GA8對(duì)膽鹽的耐受性不強(qiáng)。

表5菌株GA8對(duì)豬膽鹽的耐受性 (lg cfu·mL-1)

Table 5The bile salt-tolerance of Strain GA8 (lg cfu·mL-1)

豬膽鹽濃度/%菌落數(shù)0h2h4h0.18.04±0.067.78±0.027.84±0.040.28.04±0.064.64±0.093.94±0.130.38.04±0.063.10±0.143.10±0.140.48.04±0.0600

3　討論

3.1產(chǎn)GABA菌株的篩選

曾小群等[14]采用紙層析法從新疆酸馬奶中分離出產(chǎn)γ-氨基丁酸戊糖乳桿菌S5，在含1% L-谷氨酸鈉的MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)γ-氨基丁酸量為1.61 g·L-1。Binh等[15]從朝鮮泡菜中分離出的短乳桿菌K203，發(fā)酵72 h后，可將60 g·L-1的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化成γ-氨基丁酸，含量可高達(dá)44.4 g·L-1。謝芳等[16]從新鮮水牛乳中篩選出3株高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株G-24，G-25和G-29，鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種，在含有1%谷氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中，產(chǎn)γ-氨基丁酸含量可達(dá)0.6 g·L-1。本試驗(yàn)采用紙層析定性、HPLC-MS定量、生理生化檢驗(yàn)和16S rDNA序列同源性分析篩選出一株產(chǎn)GABA菌株，命名為GA8，GABA產(chǎn)量為3.50 g·L-1，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌。菌株GA8產(chǎn)GABA量較高，為其他高產(chǎn)GABA益生菌的篩選和研究奠定了一定的基礎(chǔ)。各分離菌株產(chǎn)GABA量的不同，可能是樣品來(lái)源、菌株種類(lèi)、發(fā)酵條件及L-谷氨酸鈉添加量的不同，造成GABA產(chǎn)量的不同。

3.2對(duì)病原菌的抑制效果

本試驗(yàn)運(yùn)用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株GA8的全菌液和上清液有抑菌能力，而菌體懸液無(wú)抑菌效果，由此可以看出，菌株GA8具有一定的抑菌性。陳光明等[17]對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)不同來(lái)源的乳酸菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株代謝產(chǎn)物有較強(qiáng)抑菌活性而菌體本身并無(wú)抑菌活性，且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)沙門(mén)氏菌抑菌作用較弱。李清等[18]從豆醬中分離的植物乳桿菌DJ-04對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用。熊濤等[19]從豬糞中篩選出的羅伊氏乳桿菌發(fā)酵全菌液有較強(qiáng)的抑制作用，這與本研究不盡相同。本研究中菌株GA8全菌液和上清液對(duì)致病菌有較好的抑制作用，菌體本身則對(duì)致病菌無(wú)抑制作用，可能是上清液中的乳酸、某種酶或細(xì)菌素起到了抑菌作用，也可能上清液中還含有其他的抑菌物質(zhì)，具體是哪種物質(zhì)還需進(jìn)一步研究。

3.3耐酸耐膽鹽效果

靳志強(qiáng)等[20]從飲料中篩選出的植物乳桿菌在pH 3環(huán)境中培養(yǎng)4 h后活菌數(shù)在106cfu·mL-1左右，可以在0.5%膽鹽中生長(zhǎng)，有較好的耐膽鹽能力。Kabore等[21]從猴面包樹(shù)種子發(fā)酵產(chǎn)物中分離出的乳酸菌分別在pH 2.5和0.3%膽鹽中培養(yǎng)4 h后均有存活。本研究中菌液在pH 2時(shí)，培養(yǎng)4 h仍有存活，活菌數(shù)能達(dá)到106cfu·mL-1以上；在0.1%豬膽鹽中培養(yǎng)4 h后，活菌數(shù)能達(dá)到107cfu·mL-1以上，0.3%豬膽鹽中培養(yǎng)4 h后活菌數(shù)只能達(dá)到103cfu·mL-1左右，而在0.4%豬膽鹽中培養(yǎng)2 h后菌株不生長(zhǎng)。表明本研究篩選出的產(chǎn)GABA植物乳桿菌有一定的耐酸能力，但耐膽鹽能力不強(qiáng)，可能是菌種性能不同所造成的。若作為微生態(tài)制劑應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，可使用包被等手段進(jìn)行處理，以提高其在胃腸道中的存活率，充分發(fā)揮其作用。

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(責(zé)任編輯侯春曉)

Screening of γ-aminobutyric acid-producing probiotics and characterization of its biological activity

XU Yu-qin1，DAI Xi-xi1，TANG Hui-qin1，GU Xiao-xiao1，PAN Kang-cheng1，2，*

(1.College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China;2.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province，Chengdu 611130，China)

The purpose of the present study was to screen a high γ-aminobutyric acid (GABA) -producing probiotics，which had the ability of biological antagonism and tolerance of acid and bile salt.The suspicious strains which producing GABA were analyzed qualitatively and quantitively by paper chromatography and high performance liquid chromatography and mass spectrometry (HPLC-MS).Combining the morphological，physiochemical properties with 16S rDNA sequencing analysis，a high GABA-producing bacterium was identified.Then the inhibition of this high GABA-producing strain against three pathogen bacteria from animal and the tolerance of acid and bile salt were performed.The results showed that the strain GA8 which isolated from pickle had high yield of GABA;it was cultured in GYP medium containing 1% L-glutamate at 37℃ for 48 h，the yield of GABA reached 3.50 g·L-1;it was identified as Lactobacillus plantarum.The bacteria liquid and supernatant of GA8 strain culture had some inhibitory effect on Salmonella pullorum，Escherichia coli and Staphylococcus aureus，and GA8 strain had no bacteriostasis ability.When the initial concentration of living bacteria was 108cfu·mL-1，the living bacteria could reach more than 106cfu·mL-1after cultured on medium with pH 2.0 for 4 h and 103cfu·mL-1after cultured on medium contained bile salt 0.3% for 4 h.The results indicated that the strain GA8 had some antibacterial properties and acid resistance，but bile salt resistant ability was not prominent.

probiotics;γ-aminobutyric acid;bioantagonism;acid and bile salt tolerance

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):502-508http://www.zjnyxb.cn

徐毓琴，戴茜茜，唐慧琴，等.產(chǎn)γ-氨基丁酸益生菌的篩選及其生物活性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3):502-508.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.23

2015-08-03

“教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(IRT0848)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)改革研究項(xiàng)目(X2011008)

徐毓琴(1990—)，女，四川眉山人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生態(tài)。E-mail:xuyuqinflavor@163.com

，潘康成，E-mail:pankangcheng71@126.com

S667.4

A

1004-1524(2016)03-0502-07