郭泰春，雷新明，李飛云，王國英，史高峰

（蘭州理工大學，甘肅　蘭州　730050）

甘草次酸對自由基清除作用的電化學研究

郭泰春，雷新明，李飛云，王國英，史高峰

（蘭州理工大學，甘肅蘭州730050）

研究了應用電化學分析方法測定甘草次酸對自由基的清除作用。用石墨烯修飾玻碳電極，建立了一種應用石墨烯修飾玻碳電極的電化學方法測定甘草次酸及其對·OH（羥基），O2·-（超氧），ROOH（脂質過氧）自由基的清除作用。實驗結果表明：甘草次酸的檢出限為2.24×10-3g/L，相對標準偏差RSD為8.94%（n=5）。同時，甘草次酸對3種自由基均具有清除作用，清除能力大小為：O2·-＞ROOH＞·OH，清除率與濃度呈良好的線性關系。該方法具有易于操作、靈敏度好、檢出限低以及價格低廉等優(yōu)點。

甘草次酸；自由基；石墨烯；修飾電極；清除能力；線性關系

在正常的人體生理代謝過程中，人體本身的防御體系可以保持體內(nèi)氧自由基的平衡［1～3］，但在機體產(chǎn)生病變、紫外線照射、化學毒物及藥物影響、電離輻射等，此時自由基的平衡體系受到破壞［4］，從而引發(fā)機體自由基穩(wěn)衡態(tài)紊亂，產(chǎn)生多余自由基，進而引發(fā)心臟病、動脈粥樣硬化、癌癥等嚴重疾病并加速衰老過程［5～7］。由于化學合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問題，因而，天然抗氧化劑是減輕細胞氧化損傷、預防相關疾病等最有效措施［8，9］。而甘草次酸是目前較有代表意義的抗衰老中藥活性成分，具有抗心律失常和抗缺氧、抗炎、抗免疫、抗腫瘤和抗氧化等作用。

石墨烯是一種新型碳材料，其碳原子緊密堆積成單層二維蜂窩狀晶格結構，具有高比表面和優(yōu)異的電化學性能，高化學物理穩(wěn)定性以及生物相容性等性質，被用于超靈敏傳感器和電化學傳感器等領域［12～13］。

自由基的檢測方法有：鄰苯三酚自氧化法、化學發(fā)光測定、熒光分光光度法、電子自旋共振技術與自旋捕捉法、氣相色譜法等已有報道。這些檢測體系重現(xiàn)性差，儀器復雜，操作繁瑣，分析時間長［14］。因此本文用石墨烯修飾玻碳電極檢測甘草次酸對自由基的清除作用的研究未見文獻報道，該方法具有操作簡單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點。

1　實驗部分

1.1實驗材料與儀器

所有實驗均在CHI660B電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）中進行，采用三電極系統(tǒng)，其中玻碳電極（Φ=3mm）作為工作電極，甘汞電極為輔助電極，鉑片電極為對電極。電熱蒸餾水器（北京科偉永興儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ5200DE，北京科偉永興儀器有限公司）。微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）。鐵氰化鉀（天津市光復科技發(fā)展有限公司），甘草酸單銨鹽（實驗室自制），石墨烯懸浮液（實驗室自制），氧化鋁粉末（0.05μm，美國GaossUnion公司）。

1.2電極處理

玻碳電極先后在1500#，2000#金相砂紙上打磨，完后用蒸餾水清洗電極表面。接著在麂皮上撒上少量Al2O3，然后滴加少量的蒸餾水，用玻碳電極上絕緣的部分稍微攪勻。直到電極表面呈鏡面，在鐵氰化鉀溶液中掃描循環(huán)伏安曲線。氧化還原峰電位之差ΔEp在80mV以下，電極方可使用。本實驗所測ΔEp=79mV。然后在打磨好的電極上滴加一定量的石墨烯懸浮液，在通風處風干數(shù)小時后待用。

1.3甘草次酸制備

稱量12g甘草酸單銨鹽，溶于100mL8%的硫酸溶液中，100℃下反應12h，得到7.5g灰白色甘草次酸粗品，水洗直至pH不再變化，50℃下干燥后，溶于氯仿中，煮沸10min，趁熱過濾，濃縮，50℃下干燥。將以上甘草次酸粗品溶于80%的乙醇溶液中，80℃下保溫，待懸浮物基本溶解，冰水浴析出沉淀，過濾，干燥，得到0.8g含量為91.59%（HPLC）精制甘草次酸。

1.4自由基的配制

羥基自由基（·OH）：稱取0.3g七水硫酸亞鐵晶體，定容至100mL容量瓶中，標為A液。精確稱取0.05g30%的雙氧水，定容至50mL容量瓶中，標為B液。A、B液均在0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

脂質過氧自由基（ROOH）：：稱取0.3g卵磷脂溶于30mL磷酸鹽緩沖溶液（G，50mm/mol，pH7.4）中，冰水浴2h，標為C液。取0.01g氯化鐵，定容至50mL容量瓶中，0.01g抗壞血酸，定容至50mL容量瓶中，分別標記為D、E液，0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

超氧自由基（O2·-）：稱取0.01g核黃素，用70%甲醇溶解定容至10mL容量瓶中，標為F液。稱取0.02g甲硫氨酸，定容至50mL容量瓶中標為H液。0～4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5自由基清除實驗

自由基產(chǎn)生體系和產(chǎn)生條件見表1，分別設置對照組和實驗組。反應原理如下：

羥基自由基（·OH）：雙氧水與亞鐵離子反應生成·OH，即H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+，由于·OH活性高［15］，存活時間太短，用儀器很難檢測到，因此在反應體系中加入抗氧化劑（捕捉劑）能有效捕捉· OH，起到一定的清除作用。

脂質過氧自由基（ROOH）：Fe3+與抗壞血酸誘導脂質體過氧化，即ROOH+Fe3+→ROO·+H++Fe2+。

超氧自由基（O2·-）：參照Beauchamp的光化學方法［16］，即在還原劑甲硫氨酸存在下，核黃素分子吸收一個光子被還原，在O2條件下，自氧化產(chǎn)生O2·-。

表1　自由基反應體系

2　結果與討論

2.1甘草次酸的電化學行為

在50mmol/LPBS（磷酸鹽緩沖溶液pH7.4），掃描速率為100mV/s，電勢范圍為-0.4～0.8V，富集時間為30s的條件下，加入一定量的甘草次酸溶液，記錄氧化峰電流和氧化峰電位。如圖1所示為修飾電極和裸電極分別測定甘草次酸的線性掃描伏安行為。結果表明：甘草次酸在裸玻碳電極上（圖1a）出現(xiàn)了1個弱的氧化峰，Epa為0.33V，而在相同緩沖液和測定條件下樣品在石墨烯修飾玻碳電極上（圖1b）的氧化峰電流明顯增大，說明石墨烯修飾玻碳電極對甘草次酸產(chǎn)生了電催化氧化作用。

圖1　甘草次酸在裸玻碳電極（a），修飾電極（b）上的線性掃描伏安圖

2.2線性范圍、檢出限

在上述緩沖溶液和測定條件下，用石墨烯修飾電極測定了不同濃度的甘草次酸的線性掃描伏安行為，濃度范圍為0.016-0.08g/L。如圖2所示（上）表示不同濃度下甘草次酸的電化學行為，由圖可知隨著濃度的不斷增加，甘草次酸的峰電流不斷增加，在濃度為0.016-0.08g/L（a-f）的范圍內(nèi)呈良好的線性范圍，如圖2（下）所示，線性回歸方程為：Ip（μA）=2c（g/L）+6.08，R2=0.995，檢出限為2.24×10-3g/L，相對標準偏差RSD為8.94%（n=5）。見表2為甘草次酸的含量測定結果與加樣回收率。

圖2　（上）表示不同濃度下甘草次酸的線性掃描伏安曲線，（下）表示甘草次酸濃度與峰電流的線性關系

表2　甘草次酸樣品的測定結果

2.3甘草次酸對自由基的清除作用

甘草次酸對·OH，O2·-，ROOH自由基的清除效果，對照組和實驗組線性掃描伏安曲線如圖3所示，在甘草次酸的出峰位置Ep=0.33V處實驗組峰電流小于對照組峰電流，說明實驗組的一部分甘草次酸用于清除自由基，證明甘草次酸對自由基具有清除作用。其清除效果見表3。由表3數(shù)據(jù)可知，甘草次酸對3種自由基的清除效果為O2·-＞ROOH＞· OH。清除率計算公式如下：

圖3　甘草次酸對自由基清除作用的線性掃描伏安曲線，b表示對照組，a表示實驗組

配制2、4、6、8、10ug/mL的甘草次酸樣品，測定其對自由基清除效果的線性伏安行為。圖4為甘草次酸對自由基清除率與濃度的關系，由圖可知甘草次酸對O2·-自由基的清除能力最強，對ROOH和· OH的清除能力次之。

圖4　甘草次酸對3種自由基的清除作用與濃度關系

表3　甘草次酸對自由基的清除率數(shù)據(jù)表

3　結語

皮膚的衰老和色斑的沉積都與自由基有著密切的關系，而大多數(shù)合成類藥物具有毒性且具有副作用，因此有必要尋找合適的天然抗氧劑來對抗和清除自由基。隨著科學技術的進步，具有清除氧自由基的作用的中藥有效成分甘草次酸，將作為抗皺、美白等化妝品的主要成分，具有發(fā)展?jié)摿?。本文建立了石墨烯修飾電極的電化學分析方法測定了甘草次酸對·OH、ROOH、O2·-自由基的電化學行為，這種方法具有成本低、靈敏度高、且易于操作等優(yōu)點。實驗測定結果滿意。

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