苗宗寧，吳衛(wèi)江，錢寒光，趙基棟

（江蘇無(wú)錫市第三人民醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫214041）

1 引 言

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一類起源于神經(jīng)外胚層，具有自我更新能力并在一定條件下分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞［1-3］。胚胎期和成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)均發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)干細(xì)胞，其存在于特殊的niches中，通過(guò)自分泌或旁分泌的方式可以產(chǎn)生多種神經(jīng)細(xì)胞因子，神經(jīng)遞質(zhì)等特異性的功能蛋白［4-5］。研究表明移植NSCs可有效地修復(fù)損傷的脊髓組織，重建神經(jīng)間的連接，治療脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）［6-9］。NSCs主要存在于哺乳動(dòng)物側(cè)腦室的室管膜下區(qū)和海馬的齒狀回顆粒下層以及脊髓中央管室管膜區(qū)等［10］。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清培養(yǎng)法進(jìn)行新生大鼠海馬NSCs體外分離培養(yǎng)，觀察其在體外增殖、分化等一系列細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，為細(xì)胞移植治療SCI提供有效的細(xì)胞來(lái)源。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生SD大鼠，由江蘇省血吸蟲(chóng)病防治研究所提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）2007-0021。

實(shí)驗(yàn)試劑及材料：DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清，Penicillin-Streptomycin，StemPro Accutase（Gibco）；B-27（Invitrogen）；表皮生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Pepro Tech）；兔抗大鼠nestin單克隆抗體，兔抗大鼠GFAP單克隆抗體，兔抗大鼠NSE多克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔Ig G（abcam）；DAPI，多聚賴氨酸（Sigma）；IX-71熒光顯微鏡（O-lympus）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus）；培養(yǎng)瓶，離心管，移液管（Corning）；sABC試劑盒（BOSTER）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）。

2.2 方法

2.2.1 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 取新生SD大鼠（出生24 h以內(nèi)），頸椎脫臼法處死，碘酒浸泡1 min后75%乙醇漂洗3次×2 min/次。剪開(kāi)頭皮及顱骨，在解剖顯微鏡下，分離出海馬區(qū)腦組織。用顯微鑷剝除腦膜及血塊并用預(yù)冷的D-Hank’s液漂洗2次，用眼科剪剪碎，Accutase蛋白酶37℃消化3 min，用彎頭滴管輕柔吹打，制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液收集沉淀細(xì)胞，加入3 ml完全培養(yǎng)基（DMEM/F-12+2%B-27+1%Penicillin-Streptomycin+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF），混勻后接種于12.5 cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，第三天開(kāi)始每3天更換培養(yǎng)液1次，2周左右傳代1次。

換液時(shí)將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液輕輕混勻后移至離心管，800 r/min離心3 min，吸出一半上清液，加入一半37℃預(yù)溫的完全培養(yǎng)基，混勻后接種至培養(yǎng)瓶。

傳代時(shí)將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液輕輕混勻后移至離心管，1 000 r/min離心3 min，吸出上清液，加入 Accutase蛋白酶37℃消化3 min，加入5 ml完全培養(yǎng)基，用彎頭滴管輕柔吹打，800 r/min離心3 min，棄去上清液收集沉淀細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

鑒定時(shí)無(wú)菌條件下取多聚賴氨酸包被的蓋玻片，置于6孔板內(nèi)，收集第三代NSCs，接種到蓋玻片上，培養(yǎng)3天后，取出蓋玻片，D-Hank’s液漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后山羊血清封閉20 min，棄血清加入兔抗大鼠nestin單克隆抗體（1∶1000），37℃孵育 2 h，PBS漂洗 3次后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔 Ig G（1∶1 000），37℃避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡下觀察。

2.2.2 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定 無(wú)菌條件下取多聚賴氨酸包被的蓋玻片，置于6孔板內(nèi)，收集第三代 NSCs，應(yīng)用誘導(dǎo)培養(yǎng)基（DMEM/F-12+10%FBS+2%B-27+1%Penicillin-Streptomycin+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF）接種到蓋玻片上，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)7天后，取出蓋玻片，D-Hank’s液漂洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次后山羊血清封閉20 min，棄血清，分別加入兔抗大鼠GFAP單克隆抗體（1∶500）和兔抗大鼠NSE多克隆抗體（1∶500），37℃孵育 2 h，PBS漂洗 3次后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔 Ig G（1∶1 000），37℃避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗后加入終濃度為100 ng/ml DAPI溶液避光狀態(tài)下行細(xì)胞核染色5 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

從海馬組織分離的細(xì)胞原代接種后，在顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)小組織團(tuán)塊以及單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，多呈圓形，大小不一，折光性強(qiáng)。接種2～3天后，可見(jiàn)細(xì)胞碎片增多，部分細(xì)胞貼壁，隨著時(shí)間的推移，懸浮細(xì)胞集聚成小細(xì)胞團(tuán)，逐漸長(zhǎng)成由細(xì)胞組成的桑葚狀細(xì)胞球，部分細(xì)胞球因體積過(guò)大出現(xiàn)細(xì)胞球中心顏色暗淡、透光性較差。體外傳代培養(yǎng)后，死亡細(xì)胞以及組織碎片減少，可見(jiàn)典型神經(jīng)球形成，免疫熒光染色結(jié)果顯示神經(jīng)球中有大量nestin陽(yáng)性細(xì)胞存在，見(jiàn)圖1。

圖1 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定。A.原代培養(yǎng)3天 ×40；B.原代培養(yǎng)10天 ×100；C.傳代培養(yǎng)7天 ×200；D.E NSCs免疫熒光染色顯示nestin陽(yáng)性細(xì)胞 ×100。Fig 1 Isolation culture and identification of the newborn rat hippocampal neural stem cells.A.The morphology of primary generation cells at 3 days×40；B.The morphology of primary generation cells at 10 days×100；C.The morphology of subculture cells at 7 days×200；D-E.NSCs immunofluorescence staining show nestin positive cells×100.

3.2 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定

用含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCs后，顯微鏡下可見(jiàn)NSCs球很快貼壁，24 h后大量貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞從NSCs球周圍長(zhǎng)出。開(kāi)始階段由于細(xì)胞密度大，以NSCs球?yàn)橹行南蛩闹芊派錉畛善L(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，邊緣部位細(xì)胞突起逐漸變長(zhǎng)、增多，與相鄰的細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中既有具有多個(gè)長(zhǎng)突起的神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞，也有具有短突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞，見(jiàn)圖2。免疫熒光染色結(jié)果可見(jiàn)大量GFAP陽(yáng)性細(xì)胞及NSE陽(yáng)性細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

圖2 NSCs誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)變化A.分化3天 ×40；B.分化7天 ×40；C.分化10天 ×100；D.分化14天 ×100。Fig 2 The cell morphological changes after NSCs differentiation at day 3，7，10 and 14

圖3 NSCs誘導(dǎo)分化后免疫熒光染色GFAP和NSE表達(dá)。Bar=100μmFig 3 The expression of NSE and GFAP identify by immunofluorescence staining after NSCs differentiation.Bar=100μm

4 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是一類原始的未分化的多潛能干細(xì)胞，具有自我更新能力，主要向神經(jīng)系統(tǒng)方向分化，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等，存在于海馬齒狀回和室管膜下區(qū)等區(qū)域［11-12］，在SCI治療的相關(guān)研究中，NSCs移植受到廣泛關(guān)注，此類方法多是通過(guò)促進(jìn)移植到SCI部位的外源性NSCs有效地向神經(jīng)元分化，促進(jìn)脊髓重建及神經(jīng)修復(fù)的作用［13-14］。因此，獲取大量NSCs并建立穩(wěn)定的分離培養(yǎng)方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)從新生大鼠海馬組織分離并培養(yǎng)了NSCs，體外可以增殖，通過(guò)條件培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為進(jìn)一步研究NSCs體內(nèi)移植后的分化和NSCs治療SCI提供了前期的技術(shù)支持。

研究表明不同部位來(lái)源的中腦神經(jīng)干細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性，即具有“區(qū)域特異性”［14］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新生小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)，由于新生小鼠海馬組織體積非常小，因此，建立適合的分離培養(yǎng)方法就很重要。神經(jīng)干細(xì)胞原代分離主要采用酶消化法和機(jī)械吹打法，研究表明酶消化過(guò)程和機(jī)械打散都對(duì)細(xì)胞的活性造成不利影響，常見(jiàn)的胰蛋白酶通過(guò)水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)使細(xì)胞分離，但其消化能力較強(qiáng)，容易造成細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)也被消化，進(jìn)而釋放其核內(nèi)的DNA，而這些DNA具有很強(qiáng)的黏性，會(huì)將分離消化的單細(xì)胞黏附在一起，從而引起細(xì)胞的損傷和死亡。機(jī)械吹打可以避免細(xì)胞膜被消化，但不易掌握吹打的次數(shù)和力度，可造成細(xì)胞膜的機(jī)械損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降及死亡［15］。這說(shuō)明需要改進(jìn)消化過(guò)程，例如換用消化能力更加溫和的酶，并且減少吸管吹打。研究發(fā)現(xiàn)accutase消化酶通過(guò)化學(xué)解離的方法來(lái)分散組織，在細(xì)胞培養(yǎng)中的損傷作用具有非特異性［16］。本實(shí)驗(yàn)中采用accutase來(lái)分散海馬組織和神經(jīng)球進(jìn)行原代和傳代分離培養(yǎng)，并輔以輕微的機(jī)械吹打，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷。由于海馬組織體積很小，分離后不通過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾而直接培養(yǎng)，死亡細(xì)胞以及組織碎片通過(guò)更換培養(yǎng)液以及液化作用可以緩慢去除，這樣可以盡可能保留存活細(xì)胞。

目前主要通過(guò)懸浮培養(yǎng)法體外培養(yǎng)NSCs，這是保持NSCs干性的重要條件［17-18］。EGF主要是維持干細(xì)胞的長(zhǎng)期存活生長(zhǎng)，可以促進(jìn)NSCs進(jìn)行對(duì)稱性分裂，產(chǎn)生的子代細(xì)胞均可繼續(xù)分裂。B-27、bFGF則起到維持細(xì)胞懸浮、抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用，bFGF還可促進(jìn)NSCs進(jìn)行非對(duì)稱性分裂，所產(chǎn)生的子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞能夠繼續(xù)分裂。bFGF與EGF同時(shí)應(yīng)用，bFGF可以顯著加強(qiáng)EGF的作用［19-21］。本實(shí)驗(yàn)以 DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輔以B27添加劑，同時(shí)加入bFGF及EGF構(gòu)成完全培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)出NSCs，并進(jìn)行了有效地增殖和分化。

Nestin是一種中間絲蛋白成分，屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)前體細(xì)胞向終末方向分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，Nestin便停止表達(dá)，故最常用來(lái)鑒定 NSCs［22］。NSE和GFAP均為一種胞漿蛋白，NSE主要表達(dá)于神經(jīng)元。GFAP屬Ⅲ型中間絲蛋白家族成員，在活化的星型膠質(zhì)細(xì)胞中大量特異性表達(dá)［23］。實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光染色可見(jiàn)大量Nestin陽(yáng)性細(xì)胞存在，表明成功培養(yǎng)出未分化的NSCs。神經(jīng)球用體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，可見(jiàn)神經(jīng)球貼壁后向四周延伸出多個(gè)突起，逐步形成相互連接，交錯(cuò)成網(wǎng)，NSE和GFAP染色顯示陽(yáng)性，說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞在一定條件下可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)選取新生大鼠海馬組織進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，盡管優(yōu)化了取材方法，仍無(wú)法避免雜細(xì)胞，因此取材與培養(yǎng)方法需要進(jìn)一步改進(jìn)，從而快速、精確的獲取NSCs。