賈昌路　徐崇志　張 銳,3*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)

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“溫138”核桃硬殼初期轉(zhuǎn)錄組序列的初步研究

賈昌路1徐崇志2張 銳2,3*

(1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 新疆 阿拉爾 843300)

為了探究“溫138”核桃硬殼出現(xiàn)露仁現(xiàn)象的根本原因，從分子水平出發(fā)，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，探索出硬殼中基因的功能。經(jīng)測(cè)序后，共得到51 521 252個(gè)reads片段，包含4 636 912 680個(gè)核苷酸序列信息，對(duì) reads 進(jìn)行拼接組裝后，共得到56 639條Unigene，序列信息長(zhǎng)度達(dá)到了46 623 389 nt；將Unigene 和 COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)表明，核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組中的 Unigene 根據(jù)COG功能可分為 25 類；根據(jù)GO功能可分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類53小類。

核桃；硬殼；轉(zhuǎn)錄組；基因功能

核桃(Juglans regia L.)又名胡桃、羌桃，為胡桃科胡桃屬多年生落葉果，是世界著名的四大干果之一。核桃中含有較為豐富的蛋白質(zhì)，被廣泛認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，經(jīng)研究表明，核桃蛋白有著與動(dòng)物蛋白相近的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。中國(guó)是核桃發(fā)源地之一，在悠久的栽培歷史中，由于核桃分布廣范，地理?xiàng)l件和氣候條件不同，加上人們長(zhǎng)期的觀察和選育，形成了極為豐富的種質(zhì)資源，如：隔年核桃、薄皮核桃、穗狀核桃等，分布范圍包括河北、云南、新疆等地[2]。

所謂轉(zhuǎn)錄組，從廣義上講，是指生物體(包括生物體中的細(xì)胞、組織等)中出現(xiàn)的所有RNA的總和，包括能夠編碼蛋白質(zhì)的RNA(即mRNA)和不能編碼蛋白質(zhì)的RNA(ncRNA，如rRNA、tRNA、mieroRNA等)；從狹義上講通常是指細(xì)胞所轉(zhuǎn)錄出的所有mRNA的總和[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)谘芯可锏倪^程中開始向后基因組時(shí)代挺進(jìn)，陸續(xù)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)，在諸多組學(xué)中，以蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)為研究重點(diǎn)，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)又較蛋白質(zhì)組學(xué)率先發(fā)展起來且應(yīng)用廣泛[5-6]。目前已有不少學(xué)者做過有關(guān)植物轉(zhuǎn)錄組的研究，2011年熊麗東[7]采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)紅花轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果共得到153 769條紅花Unigenes，隨后對(duì)Unigenes進(jìn)行了功能注釋，結(jié)果顯示：將Unigenes與nr庫(kù)比對(duì)，得到相似基因65 536條；與Swiss-Prot庫(kù)比對(duì)，得到相似基因56 843條；與KEGG庫(kù)比對(duì)，得到相似基因35 056條；與COG庫(kù)比對(duì)，得到相似基因11 010條。2012年李鐵柱等[8]對(duì)杜仲幼果和成熟果實(shí)進(jìn)行測(cè)序后，共獲得了64 474個(gè)Unigene片段，隨后將Unigene和COG庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共存在65 536條Unigene與COG庫(kù)中的基因相似，與GO庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，相似基因共有12 923條。2012年楊楠等[9]以紅心蠟梅H29為材料，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)得到105個(gè)與花色合成相關(guān)的Unigene，對(duì)Unigene分析發(fā)現(xiàn)，其平均長(zhǎng)度677 bp，在200～500 bp之間的有46個(gè)片段，在500～1 000 bp之間的有24個(gè)片段，大于1 000 bp的有21個(gè)片段。將Unigene與nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Unigene都具有較高的同源度(E值<10-5)，其中存在45條片段與nr數(shù)據(jù)相比，同源度極高(E值<10-50)。

“溫138”核桃是從原產(chǎn)于新疆的紙皮核桃的實(shí)生后代中選育出來的一個(gè)核桃品種，該品種與紙皮核桃相比，品質(zhì)差異不大(通過化學(xué)測(cè)定方法對(duì)兩個(gè)核桃品種中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果)。但是，“溫138”核桃不同于紙皮核桃的特性主要表現(xiàn)為“溫138”核桃在成熟后，核桃硬殼包被不完全，出現(xiàn)露仁現(xiàn)象。為了研究“溫138”核桃露仁的主要原因，本文借助于現(xiàn)有的高效測(cè)序技術(shù)——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析“溫138”核桃硬殼中遺傳信息，為從分子角度探究“溫138”核桃露仁的真正原因奠定基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣木本糧油核桃林場(chǎng)種植的“溫138”核桃為試驗(yàn)材料，于2014年6月13日進(jìn)行采樣，將采摘的核桃果實(shí)去青皮，用小刀將核桃切成片狀，剔除核桃內(nèi)的果仁，僅將核桃的內(nèi)果皮保留，并迅速切碎，用液氮進(jìn)行速凍，保存至-70℃冰箱，備用。

1.2核桃硬殼RNA提取

核桃硬殼中總RNA的提取采用pBIOZOL植物組織RNA提取試劑盒(BioFlux)，具體操作參照說明書進(jìn)行。

1.3核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序、數(shù)據(jù)組裝及基因功能注釋

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作委托于深圳華大公司完成。對(duì)核桃硬殼形成過程中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序后，將測(cè)序圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(raw reads)，然后再通過filter_fq軟件對(duì)轉(zhuǎn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到最終所需的數(shù)據(jù)(clean reads)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)最終數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到所需要的Unigene，最后再對(duì)所得的Unigene進(jìn)行分析、功能注釋。

2　結(jié)果與分析

對(duì)核桃硬殼中的RNA進(jìn)行測(cè)序后，共得到55 585 658條reads片段，利用filter_fq軟件對(duì)reads進(jìn)行過濾后共得到51 521 252個(gè)reads片段，其中包含有4 636 912 680個(gè)核苷酸序列信息，質(zhì)量大于20%的堿基占97.94%，中間未知序列片段為0%，GC%含量達(dá)到了46.18%，由此可以看出，所測(cè)的轉(zhuǎn)錄組序列較為可靠，能夠?yàn)閿?shù)據(jù)組裝提供很好的數(shù)據(jù)。

2.1核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

用over-lap的方法對(duì)51 521 252個(gè)reads片段進(jìn)行拼接，共得到Contig片段94 301條，序列信息長(zhǎng)度達(dá)到了39 186 004 nt，平均長(zhǎng)度為416 nt；其中，長(zhǎng)度在100-200 nt范圍內(nèi)的Contig片段達(dá)到了51 008條，比例占到了54.09%；在200-300 nt范圍內(nèi)的Contig片段達(dá)到了14 017條，比例占到了14.86%；在300-400 nt范圍內(nèi)的Contig片段達(dá)到了6 868條，比例占到了7.28%；在400-500 nt范圍內(nèi)的Contig片段達(dá)到了4 002條，比例占到了4.27%；大于等于500 nt的Contig片段達(dá)到了18 386條，比例占到了19.50%(如表1、圖2所示)。由以上數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，用over-lap的方法對(duì)reads片段進(jìn)行拼接后得到的Contig片段效果較好。

表1　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Contig數(shù)據(jù)組裝情況統(tǒng)計(jì)

圖2　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Contig數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布圖

由reads片段拼接組裝得到Contig片段后，再利用Contig片段數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的拼接組裝，得到Unigene。通過拼接組裝后，共得到56 639條Unigene，序列信息長(zhǎng)度達(dá)到了46 623 389 nt，平均長(zhǎng)度為823 nt，N50為 1 543 nt；其中，長(zhǎng)度在100～500 nt范圍內(nèi)的Unigene片段達(dá)到了30 701條，比例占到了54.20%；在500～1 000 nt范圍內(nèi)的Unigene片段達(dá)到了9 434條，比例占到了16.66%；在1 000～1 500 nt范圍內(nèi)的Unigene片段達(dá)到了6 444條，比例占到了11.38%；在1 500～2 000 nt范圍內(nèi)的Unigene片段達(dá)到了4 325條，比例占到了7.64%；大于等于2 000 nt的Unigene片段達(dá)到了5 735條，比例占到了10.13%(如表2、圖3所示)。

表2　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)組裝情況統(tǒng)計(jì)

圖3　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布圖

將Unigene 進(jìn)行覆蓋度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有37 071條 Unigene 能夠與測(cè)序的原始數(shù)據(jù) reads 相對(duì)應(yīng)，并且對(duì)應(yīng)關(guān)系也各不相同，depth(測(cè)序深度——即reads堿基數(shù)與Unigene序列長(zhǎng)度的比值)和coverage(覆蓋度——即Unigene中有reads覆蓋的堿基數(shù)與Unigene序列長(zhǎng)度的比值)表示，其中，depth在0. 059 9-33 899. 706 6的范圍內(nèi)，coverage在4. 80%-100. 00%的范圍內(nèi)。對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度在200-15 681 nt，GC%在14.85%-71.98%，不存在未知序列，說明通過拼接組裝后得到的Unigene效果較好。

2.2Unigene的功能分類與分析

2.2.1Unigene 的COG功能的分類及分析

COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)，是基于細(xì)菌、藻類、真核生物具有完整基因組的編碼蛋白、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建的，將Unigene和COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)Unigene可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)，進(jìn)而從宏觀上了解相應(yīng)物種的基因功能分布特征。

通過將樣品的Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有43 521條Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性。將比對(duì)出具有相似性的Unigene進(jìn)行分類，可以分為25類(如圖4所示)，并對(duì)每一類的基因數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3)。從圖與表中可以看出，Unigene的COG功能比較全面，其中，涉及到普通功能的Unigene數(shù)量最多，為8 196條；而與核結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因只有10條，與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因只有12條，其他相關(guān)功能的基因也有不同的差異，如表3所示。

圖4　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Unigene COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖

功能代號(hào)COG功能分類基因數(shù)量ARNAprocessingandmodification384BChromatinstructureanddynamics468CEnergyproductionandconversion1043DCellcyclecontrol,celldivision,chromosomepartitioning1498EAminoacidtransportandmetabolism1680FNucleotidetransportandmetabolism425GCarbohydratetransportandmetabolism2490HCoenzymetransportandmetabolism764ILipidtransportandmetabolism912JTranslation,ribosomalstructureandbiogenesis2243KTranscription4658LReplication,recombinationandrepair3987MCellwall/membrane/envelopebiogenesis1464NCellmotility320OPosttranslationalmodification,proteinturnover,chaperones3013PInorganiciontransportandmetabolism1326QSecondarymetabolitesbiosynthesis,transportandcatabolism968RGeneralfunctionpredictiononly8196SFunctionunknown1896

續(xù)上表

功能代號(hào)COG功能分類基因數(shù)量TSignaltransductionmechanisms3883UIntracellulartrafficking,secretion,andvesiculartransport989VDefensemechanisms314WExtracellularstructures12YNuclearstructure10ZCytoskeleton578

2.2.2Unigene 的GO功能分類與分析

Gene Ontology(簡(jiǎn)稱GO)是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，是通過一套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表(controlled vocabulary)來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO從三個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行了描述，分別為基因的分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)、參與的生物過程(biological process)。根據(jù)NR注釋信息，使用Blast2GO軟件得到Unigene的GO注釋信息，然后用WEGO軟件對(duì)所有Unigene做GO功能分類統(tǒng)計(jì)，從宏觀上認(rèn)識(shí)該物種的基因功能分布特征。

通過對(duì)樣品Unigene的GO功能進(jìn)行分析，共有7 419條Unigene與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因呈現(xiàn)出相似性，且存在著單條Unigene與多種基因相對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象，并建立了一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而可以得到3大類53小類的分類情況，結(jié)果如圖5所示，并對(duì)每一小類的基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示。結(jié)合Unigene GO 功能分類圖與分類表，可以看出，在核桃硬殼期轉(zhuǎn)錄組序列的GO功能中，參與生物過程的基因總數(shù)遠(yuǎn)高于表現(xiàn)出分子功能的基因總數(shù)，在三大主要基因功能中，調(diào)控細(xì)胞與細(xì)胞分裂的基因最多，達(dá)到了5 048個(gè)，而在基因的分子功能區(qū)中，具有連接功能的基因數(shù)最多，達(dá)到了3 675個(gè)，在生物過程區(qū)中，調(diào)控細(xì)胞過程的基因數(shù)最多，達(dá)到了4 717個(gè)，其他功能的基因數(shù)也存在著較大的差異，具體統(tǒng)計(jì)如表4所示。

圖5　核桃硬殼轉(zhuǎn)錄組Unigene GO功能分類

OntologyClassNumberbiological_processbiologicaladhesion59biological_processbiologicalregulation1960biological_processcellularcomponentorganizationorbiogenesis1266biological_processcellularprocess4717biological_processdevelopmentalprocess1340biological_processestablishmentoflocalization1217biological_processgrowth357biological_processimmunesystemprocess416biological_processlocalization1304biological_processlocomotion9biological_processmetabolicprocess4520biological_processmulti-organismprocess767biological_processmulticellularorganismalprocess1324biological_processnegativeregulationofbiologicalprocess475biological_processpositiveregulationofbiologicalprocess421biological_processregulationofbiologicalprocess1801biological_processreproduction715biological_processreproductiveprocess672biological_processresponsetostimulus2667biological_processrhythmicprocess46biological_processsignaling821biological_processsingle-organismprocess3278cellular_componentcell5408cellular_componentcelljunction332cellular_componentcellpart5408cellular_componentextracellularmatrix7cellular_componentextracellularmatrixpart1cellular_componentextracellularregion510cellular_componentextracellularregionpart5cellular_componentmacromolecularcomplex726

續(xù)上表

OntologyClassNumbercellular_componentorganelle4181cellular_componentorganellepart1215cellular_componentsymplast332cellular_componentvirion1cellular_componentvirionpart1molecular_functionantioxidantactivity48molecular_functionbinding3675molecular_functioncatalyticactivity3670molecular_functionelectroncarrieractivity102molecular_functionenzymeregulatoractivity90molecular_functionmetallochaperoneactivity2molecular_functionmoleculartransduceractivity123molecular_functionnucleicacidbindingtranscriptionfactoractivity235molecular_functionnutrientreservoiractivity16molecular_functionproteinbindingtranscriptionfactoractivity21molecular_functionproteintag1molecular_functionreceptoractivity59molecular_functionstructuralmoleculeactivity188molecular_functiontransporteractivity491

3　討論

2014年，蔣弘剛[10]對(duì)花椒皮刺中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，共得到2*100 bp的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過拼接組裝后得到45 057條長(zhǎng)度大于200 bp的Unigene，總長(zhǎng)度為610 bp，N50為846 bp。將得到的Unigene與COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、注釋，分別注釋了70.26%，43.34%的Unigene。

2012年，李鐵柱等[11]對(duì)杜仲的果實(shí)與葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共得到54 471 338條reads，對(duì)reads進(jìn)行拼接組裝后，得到452 421條Contig，總長(zhǎng)度達(dá)到了90 705 736 nt；對(duì)Contig進(jìn)一步拼接組裝后，得到49 610條Unigene，總長(zhǎng)度達(dá)到了37 616 729 nt。隨后，將Unigene與COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、注釋，發(fā)現(xiàn)有與COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性的Unigene條數(shù)分別為125 934條、8 260條。

2013年，杜艷玲[12]運(yùn)用 HiSeqTM 2000測(cè)序平臺(tái)，對(duì)人參根、莖、葉的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行組裝，分別獲得53 870，69 591，66 045條 Unigenes；序列的平均長(zhǎng)度分別為553 nt，686 nt，644 nt。將人參根、莖、葉的Unigene分別與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，有 30 519、37 539、36 078 條Unigenes被歸類到61個(gè)GO功能類別中；分別與COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，有11 755、15 646、14 803條Unigenes 被歸類到25個(gè)COG功能類別中。

實(shí)驗(yàn)對(duì)“溫138”核桃硬殼中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序后，共得到51 521 252個(gè)reads片段，其中包含有4 636 912 680個(gè)核苷酸序列信息，對(duì) reads 進(jìn)行拼接組裝，共得到94 301條Contig片段，序列信息長(zhǎng)度達(dá)到了39 186 004 nt，平均長(zhǎng)度為416 nt，在Contig 數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行拼接組織，共得到56 639條Unigene，序列信息長(zhǎng)度達(dá)到了46 623 389 nt，平均長(zhǎng)度為823 nt，N50為 1 543 nt；將 Unigene與 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有43 521條Unigene與COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因相似，與GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共有7 419條Unigene與GO庫(kù)中的基因相似。

4　結(jié)論

與前人在轉(zhuǎn)錄組方面的研究相比，本次實(shí)驗(yàn)所得的轉(zhuǎn)錄組序列信息量大，且組裝效果較好，得到的Unigene的可信度高，能夠反映出“溫138”核桃硬殼中基因的功能情況。

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The Study of Transcriptome Sequences in Harden Endocarp of ‘Wen138’ Walnut

Jia Changlu1Xu Chongzhi2Zhang Rui2,3*

(1 College of Plant Science and Technology,Tarim University，Alar， Xinjiang 843300) (2 Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Alar， Xinjiang 843300) (3 College of Life Science，Tarim University，Alar， Xinjiang 843300)

In order to explore the reason of bared nut for ‘Wen 138’ walnut, transcriptome sequencing technology were used, the function of genes in hard shell walnut was investigated. A total of 51， 521, and 252 reads fragment contains 4, 636, 912 and 680 nucleotides sequence were obtained, and got 56 639 Unigene fragment after splicing and assembling with the sequence information of 46 623 389 nt；Aligned with the COG database, Unigene in the transcriptome of ‘Wen 138’walnut could be broadly divided into 25 classes according to the function. The Unigene GO functions could be broadly divided into biological processes, cellular components and molecular function major major categories of 53 subsecs.

walnut; hard shell; transcriptome; gene ontology

2015-08-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31260469)

賈昌路(1991-)，男，2014級(jí)碩士研究生，主要從事核桃露仁分子機(jī)理研究。E-mail：429315095@qq.com

?E-mail：zhrgsh@163.com

1009-0568(2016)03-0011-09

S664.1；Q789

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.003