邵禮梅，王云龍

（黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江雞西158100）

不同炮制方法的延胡索高效液相色譜指紋圖譜研究

邵禮梅，王云龍

（黑龍江省雞西市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，黑龍江雞西158100）

目的建立不同炮制方法延胡索藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法采用HPLC法，以延胡索乙素為內(nèi)參照物，色譜柱為Extent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5*m），流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），三乙胺調(diào)pH至6.5，梯度洗脫程序?yàn)?～10 min時30%～40%A，10～20 min時40%～45%A，20～60 min時55%～80%A，60～70 min時80%A，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為35℃。結(jié)果用所建立的方法對14批延胡索藥材進(jìn)行指紋圖譜分析，確定了13個共有峰，建立了延胡索藥材的共有模式。在14批延胡索樣品中有12批樣品的指紋圖譜相似度在0.9以上。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為延胡索藥材的質(zhì)量控制提供參考。

延胡索；炮制；高效液相色譜法；指紋圖譜

延胡索收載于2010年版《中國藥典（一部）》，別名元胡、玄胡、玄胡索，為罌粟科植物延胡索Cordlis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖，性溫，味辛、苦，歸肝、脾經(jīng)，主要用于胸脅、脘腹疼痛、經(jīng)閉疼痛、產(chǎn)后瘀阻、跌打腫痛，臨床用醋制延胡索療效更佳。目前，多采用高效液相色譜（HPLC）法控制質(zhì)量，僅以延胡索中的鎮(zhèn)痛活性成分延胡索乙素為指標(biāo)進(jìn)行含量測定［1-2］。延胡索指紋圖譜研究雖已有學(xué)者涉足［3-5］，但對不同醋制方法炮制后延胡索的指紋圖譜評價未見報道［6-9］。本研究中所建立的方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為延胡索藥材的質(zhì)量控制提供了參考?，F(xiàn)報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

2010A型高效液相色譜儀，紫外檢測器，LCsolution色譜工作站（日本島津公司）；AG285型電子天平（德國Sartorius公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2試藥

甲醇、乙腈為色譜純，磷酸、三乙胺、氨水為分析純，水為二次蒸餾水；延胡索乙素對照品（批號為110726-200409）購于中國食品藥品檢定研究院；延胡索藥材共14批，經(jīng)鑒定均為罌粟科植物延胡索Cordlis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖。

2　方法與結(jié)果

2.1樣品處理

樣品炮制方法：為排除產(chǎn)地不同對延胡索指紋圖譜的影響，只選擇了延胡索藥材的3個產(chǎn)地（陜西，浙江，江西），并按不同炮制方法分成14個樣品，藥材來源見表1。其中，樣品14未經(jīng)炮制；樣品1、樣品4、樣品10、樣品11采用醋炙法，取100 g藥材，加米醋20 g，拌勻，悶透，置鍋內(nèi)，炒至規(guī)定程度時，取出，放涼；樣品2、樣品6、樣品12采用醋煮法，取100 g藥材，加醋20 g，煮至溶液完全被吸盡，取出，干燥；樣品3、樣品5、樣品7、樣品8、樣品9、樣品13采用醋蒸法，取100 g藥材，加醋20 g，蒸透，取出，干燥。

樣品預(yù)處理：將炮制后的13個樣品和1批生品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎成粗粉，置密封袋中，在棕色玻璃干燥器中保存。

2.2高效液相色譜測定方法

2.2.1色譜條件

色譜柱：Extent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），三乙胺調(diào)pH至6.5，梯度洗脫，程序?yàn)?～10 min時30%～40%A，10～20 min時40%～45%A，20～60 min時55%～80%A，60～70 min時80%A；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1　延胡索樣品來源

2.2.2溶液制備

稱取延胡索乙素對照品約10mg，精密稱定10.84mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。取延胡索藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇-氨水（20∶1）25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取20 min，放冷，再超聲提取20 min，放冷，重新稱定質(zhì)量，用甲醇-氨水（20∶1）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密吸取濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，用甲醇分次溶解置5 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取延胡索（No.1）粉末約1.0 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計算各色譜峰相對于內(nèi)參比峰延胡索乙素（7號峰）的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD＜3.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取延胡索樣品（No.1）6份，各1.0 g，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計算各色譜峰相對于內(nèi)參比峰延胡索乙素（7號峰）的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD＜3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取延胡索樣品（No.1）制得1份供試品溶液，室溫下密閉貯存，分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣分析，計算各色譜峰相對于內(nèi)參比峰延胡索乙素（7號峰）的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果的RSD＜3.0%（n=6），表明延胡索供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3指紋圖譜及分析

2.3.1指紋圖譜

取14批不同炮制方法所得的延胡索藥材，分別制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。

通過對照品加入法和比對保留時間，確定了7號峰為延胡索乙素色譜峰，并將其設(shè)為參比峰，另有12個色譜峰，共計13個色譜峰，見圖1。

2.3.2不同炮制方法延胡索藥材樣品的聚類分析

將14批按不同炮制方法得到的延胡索樣品各色譜峰面積除以取樣量，得到單位質(zhì)量的延胡索樣品峰面積，然后比較。將所得峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS聚類分析軟件，結(jié)果將14批不同醋制延胡索藥材樣品分為2類，結(jié)合延胡索藥材指標(biāo)成分延胡索乙素的含量測定結(jié)果，判定第Ⅰ類質(zhì)量較好，第Ⅱ類質(zhì)量稍差。聚類譜系圖見圖2。

2.3.3延胡索樣品共有模式

根據(jù)14批不同醋制延胡索藥材樣品聚類分析結(jié)果，選定其中較好的11批樣品建立共有模式，應(yīng)用國家藥典委員會推出的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”對14批延胡索藥材進(jìn)行相似度評價，色譜圖見圖3。

圖1　延胡索高效液相色譜圖

2.3.4指紋圖譜相似度評價

結(jié)合聚類分析和延胡索乙素含量測定結(jié)果，選取第Ⅰ類11批樣品建立共有模式。將此11批樣品的液相色譜所得數(shù)據(jù)文件進(jìn)行轉(zhuǎn)換后導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”，以0.5 min為時間窗寬度進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，生成對照譜圖。再將其余3批經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后的延胡索樣品色譜圖全譜導(dǎo)入軟件，計算14批不同醋制延胡索藥材樣品與對照圖譜的相似度，結(jié)果見表2。相似度以0.90為限，在其上的樣品質(zhì)量較好，在其下的樣品質(zhì)量稍差，采用相似度軟件計算結(jié)果與SPSS聚類分析結(jié)果相同，2種方法得到了相互驗(yàn)證。

圖2　延胡索聚類譜系圖

圖3　參與共有模式建立的11批延胡索樣品色譜圖和生成的高效液相對照色譜圖

表2　相似度計算結(jié)果

3　討論

3.1流動相的選擇

延胡索藥材含有較多的生物堿類化學(xué)成分，等度洗脫解決不了各色譜峰的分離問題，故選擇了梯度洗脫系統(tǒng)。延胡索藥材含生物堿類化合物，通常采用緩沖鹽或離子對試劑作為流動相，但磷酸鹽緩沖液及離子對試劑對儀器和色譜柱損害較大，均不可取，曾嘗試過乙腈-0.1%醋酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%醋酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液，結(jié)果流動相加入醋酸會使基線不穩(wěn)、噪聲較大，影響弱小色譜峰的檢測。故采用磷酸水溶液與有機(jī)溶劑搭配，而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相洗脫能力較強(qiáng)，相對分離能力較弱，得不到更多數(shù)量的色譜峰。相比之下，以甲醇-0.1%磷酸水系統(tǒng)能使樣品各色譜峰均得到較好分離，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)pH至6.5）系統(tǒng)為HPLC法分析的流動相。

3.2波長選擇

采用紫外檢測器對不同醋制方法制得的延胡索樣品進(jìn)行各種波長測定，包括220，231，240，245，250，256，260，265，270，280，290，312 nm。結(jié)果在280 nm波長處，參比峰延胡索乙素峰面積最大，且其余色譜峰的峰面積也較大，故將測定波長定為280 nm。

3.3提取溶劑選擇

延胡索主要成分為生物堿，參照2010年版《中國藥典（一部）》中延胡索的提取方法，選甲醇-氨水（20∶1）提取生物堿類成分色譜峰信息明顯，故確定提取溶劑為甲醇-氨水（20∶1）。

3.4聚類分析

通過聚類分析與相似度計算結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)與14批延胡索色譜峰量化后的結(jié)果判斷，延胡索炮制后總生物堿類成分的峰強(qiáng)度有所提高，醋炙、醋煮與醋蒸總生物堿類成分的峰強(qiáng)度較高，效果較好，三者無明顯差異，醋煮總生物堿類成分的峰強(qiáng)度略低于醋炙與醋蒸，但都高于生品。

［1］關(guān)強(qiáng)，王云龍，杜遵義.高效液相色譜法測定延胡索藥材中延胡索乙素的含量［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2009，16（11）：78-79.

［2］劉梅，湯樹良，張文惠.HPLC色譜指紋圖譜鑒別夏天無和延胡索藥材［J］.中藥材，2003，26（9）：629-631.

［3］李先端，馬志靜，毛淑杰.不同品種醋制延胡索指紋圖譜的比較研究［J］.中藥材，2007，30（2）：144-146.

［4］竇志英，孫巍，張敏，等.陜西產(chǎn)延胡索藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，26（3）：150-153.

［5］張捷，黃榮華.HPLC測定延胡索不同炮制品中延胡索乙素含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2006，21（5）：209-210.

［6］陳旭，陸兔林，張先洪.HPLC測定延胡索不同炮制品中延胡索乙素含量［J］.中成藥，2003，25（9）：726-727.

［7］魏良兵，孟楣，程璠，等.不同醋炙延胡索中延胡索乙素的含量變化［J］.中藥材，2008，31（4）：494-495.

［8］詹漢英，謝彩娟，楊龍梅，等.不同產(chǎn)地延胡索藥材RP-HPLC指紋圖譜及質(zhì)量研究［J］.藥物分析雜志，2008，28（6）：884-887.

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HPLC Fingerprint Analysis of Different Processing Methods of Cordlis Rhizoma

Shao Limei，Wang Yunlong
（Jixi Center for Food and Drug Control，Jixi，Heilongjiang，China 158100）

ObjectiveTo establish the HPLC fingerprint analysis for the quality control of different processing methods of Cordlis Rhizoma.MethodsThe separation was performed on an Extent-C18analytical column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with the mobile phase consisting of methanol（A）and0.1%phosphoric acid（B），adjusted pH to 6.5 with triethylamine，with gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min.Elution procedure：0-10 min，30%-40%A；10-20 min，40%-45%A；20-60 min，55%-80%A；60-70 min，80%A.The wavelength of measurement was 280 nm and the column temperature was set at 35℃.Results14 batches of CordlisRhizoma were determined under the condition described above.13 peaks were selected on the chromatographic fingerprints of Cordlis Rhizoma，the mutual model of Cordlis Rhizoma was established and the similarities were calculated.The similarity of 12 samples in all 14 samples were more than 0.9.ConclustionThe method is sample and accuracy with good reproducibility and can be used as a quality control method for Cordlis Rhizoma.

Cordlis Rhizoma；processing；HPLC；fingerprint

R284．1；R286．0；R287．71

A

1006－4931（2016）14－0041－04

邵禮梅（1979-），女，黑龍江雞西人，主要從事中藥質(zhì)量檢驗(yàn)工作，（電子信箱）18652257@qq.com。參考文獻(xiàn)：

2016－02－07）