魏楠，朱強強,3，陳際名,3，李彤,3，李亦凡，黃業(yè)偉,3，馬嘯*，王宣軍，盛軍

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茶多糖對阿霉素抑制肺癌A549細胞增殖作用的影響

魏楠1,2，朱強強1,2,3，陳際名1,2,3，李彤1,2,3，李亦凡1,2，黃業(yè)偉1,2,3，馬嘯1,2*，王宣軍1,2，盛軍1,2

1. 云南農(nóng)業(yè)大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南昆明650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院云南省茶深加工工程技術(shù)研究中心，云南昆明650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明650201

肺癌是全世界目前發(fā)病率和死亡率最高的癌癥之一，當前治療惡性腫瘤的主要手段之一是化療，阿霉素是臨床常用的化療藥物，然而該藥物毒性較大，長期使用可發(fā)生劑量依賴性的不可逆的心肌病變、骨髓抑制等，同時其多藥耐藥性的存在也使它在臨床應用受到一定限制。為了減少阿霉素的毒副作用，通過體外培養(yǎng)人肺癌A549細胞，將茶葉提取物茶多糖與阿霉素聯(lián)用，加入A549細胞，24?h后以噻唑藍（MTT）法檢測細胞存活率。結(jié)果表明，當阿霉素質(zhì)量濃度為3?mg·L-1時，對肺癌A549細胞的抑制效果最明顯；不同濃度茶多糖與1、2、3?mg·L-1阿霉素聯(lián)用，以2?mg·L-1阿霉素與6?mg·L-1茶多糖聯(lián)用時對肺癌A549細胞的抑制效果最明顯，且優(yōu)于單獨使用3?mg·L-1阿霉素的效果。阿霉素可誘導A549細胞凋亡，茶多糖與阿霉素聯(lián)用可減少阿霉素的使用劑量，增強阿霉素對肺癌A549細胞的增殖抑制作用。

茶多糖；阿霉素；抗腫瘤

目前化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，在腫瘤根治性治療、輔助治療、姑息治療中發(fā)揮重要作用。而常用的化療藥物阿霉素（DOX）屬于高效廣譜抗癌藥物，在臨床應用時，主要通過插入細胞DNA，引發(fā)拓撲異構(gòu)酶Ⅱ破壞DNA的三級結(jié)構(gòu)來發(fā)揮藥效[1]。迄今為止，阿霉素單獨或與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥，均被認為是治療實體腫瘤，如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等的一種強有力的化療藥物[2]。但阿霉素對心臟、腎臟及神經(jīng)等正常組織細胞有較嚴重的毒副作用，加之用藥量大，且能到達病灶部位發(fā)揮抗腫瘤的比例很低，降低了生物利用度；此外，還有一些腫瘤細胞會對藥物失去敏感性等，這些缺陷嚴重限制了阿霉素臨床藥效的發(fā)揮[3-4]。

糖類是自然界最豐富的有機化合物，也是重要的生物高分子化合物，多糖及其復合物分布廣泛，具有多種多樣的生物學功能[5-6]。茶葉多糖（TPS）是從茶葉中提取出來的具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)復雜的雜多糖或其復合物。近年來文獻報道了茶葉具有廣泛的藥理和營養(yǎng)價值，其生物活性與茶葉中所含的活性成分密切相關(guān)。茶多酚、茶色素、咖啡堿等生理活性成分已研究較多，而茶葉多糖的研究則相對較少，隨著對多糖研究的日益深入，發(fā)現(xiàn)茶葉多糖在抗腫瘤方面有一定效果[7-9]。因此，本研究旨在探討茶多糖與抗癌藥物阿霉素聯(lián)用對肺癌細胞A549的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

阿霉素購自瑪雅試劑有限公司；人肺癌細胞系A549取自實驗室液氮凍存；DMEM 高糖培養(yǎng)基、牛血清購自Hyclone公司；吖啶橙、噻唑藍（MTT）購自Genview公司；DMSO購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。DAPI染液購自上海麥約爾生物技術(shù)有限公司；RIPA細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；Reagent A/B 購自天根生化科技有限公司；30%聚丙烯酰胺購自美國Bio-RAD公司；Anti-rabbit Ig-G、Anti-mouse Ig-G購自R&D Systems China；Magic-Marker購自Invitrogen公司；Prestained Protein Larder購自Thermo公司；0.5M Tris-Hcl Buffer pH-6.8、1.5?mol·L-1Tris-Hcl Buffer pH-8.8購自Bio-RAD公司；TEMED購自Sigma公司；BCA試劑購自Beyotim公司；PVDF膜購自Millpore公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、TRIS購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶多糖提取

茶多糖提取采用熱水浸提、乙醇沉淀法。提取溫度70~80℃，提取時間1?h，重復提取3次，料液比為1:10。醇沉時乙醇濃度（體積分數(shù)）為80%。加水凍干10次，在此條件下，將50?g茶葉進行提取，獲得茶多糖14.48?g。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞復蘇后培養(yǎng)于37℃ 5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，使用加入10%血清和1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。每日觀察細胞生長情況，待細胞鋪滿整個培養(yǎng)皿底部80%后，進行細胞傳代。

1.2.3 MTT測細胞存活率

使用96孔板將A549細胞分為12組，每組8個平行，每孔細胞接種量為5×105個，分別為空白、對照、阿霉素組，阿霉素實驗組處理梯度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10?mg·L-1；阿霉素與茶多糖聯(lián)用組為1、2、3?mg·L-1的阿霉素與茶多糖聯(lián)用，茶多糖質(zhì)量濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7、8?mg·L-1，避光培養(yǎng)24?h后，吸走上清，PBS洗1次，加入MTT，避光處理4?h，棄去上清，每孔加入150?μL DMSO，待紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶標儀在波長492?nm處測量吸光值，計算存活率。

存活率=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%

1.2.4 DAPI熒光染色觀察細胞凋亡

通過MTT測細胞存活率的實驗篩選出肺癌A549細胞存活率最低的聯(lián)用濃度，按照分組將細胞以每孔5×105個的數(shù)目接種于事先放置爬片的12孔板上進行培養(yǎng)，待細胞貼壁生長后進行藥物處理30?min，多聚甲醛固定20?min，將爬片放置在滴有DAPI染液的載玻片上靜置20?min，然后在熒光顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.5 免疫蛋白印跡

通過MTT測細胞存活率的實驗篩選出肺癌A549細胞存活率最低的聯(lián)用濃度，將細胞以每板5×106個的數(shù)目接種于100?mm培養(yǎng)皿，待細胞貼壁生長后，加入藥物處理半小時，棄去上清，每板加入300?μL裂解液（RIPA裂解液∶PMSF為100∶1）放入冰盒處理半小時，刮下培養(yǎng)皿上的蛋白，4℃，1?500?r·min-1離心10?min，取上清進行BCA蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果進行制樣，離心，95℃加熱10?min。將樣品逐一加入事先配制好的膠板，50?V，30?min；120?V，70?min，轉(zhuǎn)膜1?h，5% BSA封閉1?h，加一抗4℃過夜，然后用1xPBST洗膜3次，加二抗常溫孵育1?h，1xPBST洗膜3次，曝光。

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行分析，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）進行均值比較，<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量阿霉素誘導的A549細胞存活率

以質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10?mg·L-1的阿霉素處理A549細胞，之后以MTT檢測細胞存活率，結(jié)果顯示，當阿霉素質(zhì)量濃度為3?mg·L-1時，A549細胞的存活率最低（<0.01）（圖1）。

2.2 阿霉素與茶多糖聯(lián)用對A549細胞存活率的影響

以3?mg·L-1阿霉素與不同濃度茶多糖聯(lián)用處理A549細胞，發(fā)現(xiàn)細胞存活率都有所下降（圖2-A）。為了減少阿霉素的毒副作用，試驗將阿霉素的質(zhì)量濃度降低到2?mg·L-1、1?mg·L-1與茶多糖聯(lián)用，當阿霉素質(zhì)量濃度為2?mg·L-1時，發(fā)現(xiàn)6?mg·L-1茶多糖與阿霉素聯(lián)用對肺癌A549細胞的抑制效果最明顯（圖2-B）；當阿霉素質(zhì)量濃度為1?mg·L-1時，1?mg·L-1和3?mg·L-1茶多糖與阿霉素聯(lián)用對肺癌A549細胞的抑制效果最優(yōu)（圖2-C）。為了篩選出最佳的聯(lián)用濃度，使得阿霉素的毒副作用及A549細胞的存活率較低，試驗將對細胞抑制效果明顯的聯(lián)用濃度作了對比實驗，結(jié)果如圖2-D所示。從圖中可以看出，當阿霉素質(zhì)量濃度為2?mg·L-1，茶多糖質(zhì)量濃度為6?mg·L-1時，二者聯(lián)用對肺癌A549細胞的抑制效果明顯優(yōu)于其他聯(lián)用濃度（<0.001）。因此認為適當?shù)臐舛鹊牟瓒嗵桥c阿霉素聯(lián)用，可以增強阿霉素對肺癌A549細胞的抑制作用。

注：A：3?mg·L-1阿霉素與茶多糖聯(lián)用；B：2?mg·L-1阿霉素與茶多糖聯(lián)用；C：1?mg·L-1阿霉素與茶多糖聯(lián)用；D：最優(yōu)聯(lián)用濃度篩選。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

2.3 茶多糖與阿霉素聯(lián)用細胞凋亡的觀察

通過DAPI熒光染色可以看出，空白對照組幾乎沒有凋亡細胞，2?mg·L-1阿霉素、3?mg·L-1阿霉素、6?mg·L-1茶多糖、6?mg·L-1茶多糖與2?mg·L-1阿霉素聯(lián)用5個實驗組中均發(fā)現(xiàn)凋亡細胞，其中以6?mg·L-1茶多糖與2?mg·L-1阿霉素聯(lián)用實驗組凋亡細胞率較高（圖3）。

2.4 茶多糖與阿霉素聯(lián)用對促凋亡蛋白表達的調(diào)節(jié)

為進一步研究茶多糖與阿霉素聯(lián)用對肺癌A549細胞的作用機制，試驗采用Western blot觀察相關(guān)促凋亡蛋白的表達量。結(jié)果顯示，與對照組相比，2?mg·L-1阿霉素、3?mg·L-1阿霉素、6?mg·L-1茶多糖及6?mg·L-1茶多糖與2?mg·L-1阿霉素聯(lián)用都能夠引起B(yǎng)AX、p53、Caspase-3蛋白的表達上調(diào)；而相較于2?mg·L-1阿霉素、3?mg·L-1阿霉素、6?mg·L-1茶多糖來看，6?mg·L-1茶多糖與2?mg·L-1阿霉素聯(lián)用時BAX、抑癌基因p53編碼的蛋白（p53）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）蛋白表達上調(diào)明顯增加（圖4-A）。對Western blot的結(jié)果進行蛋白定量（即各蛋白與?-Tubulin的比值，用來校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結(jié)果的準確性）柱形圖結(jié)果（圖4-B）與Western blot結(jié)果相一致。

3 小結(jié)與討論

茶多糖和阿霉素聯(lián)用，能夠使具有毒副作用的阿霉素在減少用量的同時不改變對肺癌A549細胞的增殖抑制作用，或許是茶多糖中含有的蛋白和氨基酸與阿霉素反應改變了其原本的結(jié)構(gòu)，從而增加了阿霉素的敏感性[10-11]，但并未得到實驗的證實。因此，為了更有效地發(fā)揮阿霉素的藥理和藥效作用，減少毒副作用，為阿霉素的合理使用提供充分的實驗依據(jù)和理論支持，筆者研究了茶多糖與阿霉素聯(lián)用對肺癌A549細胞體外增殖的抑制作用，實驗中采用MTT法檢測了單獨使用阿霉素對肺癌A549細胞增殖的抑制情況。結(jié)果顯示不同濃度阿霉素對肺癌A549細胞抑制情況有所不同，3?mg·L-1阿霉素組對肺癌A549細胞的增殖抑制作用明顯高于其他濃度。這一結(jié)果是否表明不同濃度阿霉素對細胞增殖抑制作用的不同與小劑量化療引起細胞凋亡，大劑量化療則導致細胞壞死[12]的情況有關(guān)尚需進一步研究。而通過Western blot實驗及各蛋白與α-Tubulin比值柱狀圖可以發(fā)現(xiàn)，茶多糖與阿霉素聯(lián)用組中BAX、Caspase-3及p53蛋白的表達量與單獨使用3?mg·L-1阿霉素組基本相同，這也進一步證實了MTT實驗的結(jié)果，證明了聯(lián)用的相關(guān)凋亡機制，但具體作用的相關(guān)靶點尚不清楚，需進一步深入研究。

本實驗中采用MTT法檢測肺癌A549細胞的存活率，因每次細胞接種量的細微差別，以及每次實驗中對細胞處理時的客觀因素，同一濃度的阿霉素對細胞的殺傷效果會有細微的差別。實驗中采用的茶多糖并非提純后的茶多糖，而是水提醇沉所取得的粗茶多糖，因此并不能確定純度較高的茶多糖是否具有本實驗中增加阿霉素對肺癌A549細胞殺傷的效果。在SDS-page中出現(xiàn)的差異蛋白并非只有本實驗中經(jīng)過Western bolt確定的3種凋亡蛋白，因時間和客觀環(huán)境的影響，并未對其余蛋白進行探索確定。同時在Western bolt實驗結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)單獨使用6?mg·L-1茶多糖組BAX蛋白含量表達與茶多糖和阿霉素聯(lián)用組相比差異較為明顯（<0.01），而Caspase-3及p53蛋白差異與BAX蛋白相比，差異略微較?。?0.05），猜測可能是與相關(guān)凋亡通路有關(guān)，期望在后續(xù)實驗中對此進行探索，并對本實驗中所存在的問題進一步完善和優(yōu)化。

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Tea Polysaccharide Increased Doxorubicin Inhibition of Lung Cancer A549 Cells

WEI Nan1,2, ZHU Qiangqiang1,2,3, CHEN Jiming1,2,3, LI Tong1,2,3, LI Yifan1,2, HUANG Yewei1,2,3MA Xiao1,2*, WANG Xuanjun1,2, SHENG Jun1,2

1. Key Laboratory of Puer Tea Science, Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Longrun Pu-erh Tea Academy, Yunnan Research Center for Advanced Tea Processing; Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. College of Food Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China

Lung cancer has high incidence and mortality rates around the world and chemotherapy is widely applied in cancer treatment. Doxorubicin (DOX) is a kind of chemotherapy drug which commonly used in clinical trials. However, the drug has many side effects and may cause a dose-dependent injury in the long term. These side effects include irreversible cardiopulmonary, bone marrow suppression and so on. Moreover, its mufti-drug resistance also restricts it in certain clinical application. The effect of polysaccharides of tea extract combined with doxorubicin onhuman lung cancer cell line A549 were tested in this study. A549 was first culturedwith different concentrations of DOX. After 24h culture, apotheosis ratio was determined by MTT. The results show that the DOX dose for the best inhibiting effect was 3?mg·L-1according to MTT detection. Three doses of DOX were selected to combine tea polysaccharide and suppress A549 cell survival. The combination of 2?mg·L-1DOX and 6?mg·L-1tea polysaccharide had been demonstrated to have better suppressing efficiency than 3mg·L-1DOX alone. DOX could efficiently suppress A549 cell proliferation and this inhibiting effect was enhanced by combining with tea polysaccharide, which could decrease the applied dose of DOX.

tea polysaccharides, doxorubicin, antitumor

Q539；R734.2

A

1000-369X（2016）05-477-07

2016-03-15

2016-05-16

魏楠，女，碩士研究生，主要從事茶的功效研究，E-mail：fanhuayunduan@163.com。

maxiao.ynau@qq.com