潘顯婷，陸訓(xùn)，龐茜丹，高必達(dá)，周倩*

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萵苣葉斑病菌的分離鑒定及弱毒菌株致病力的衰退

潘顯婷1,2，陸訓(xùn)1,2，龐茜丹1,2，高必達(dá)1,2，周倩1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128)

利用組織分離法，從感染葉斑病的萵苣葉片上分離得到4株真菌，ITS序列分析鑒定為匍柄霉(spp)。科赫氏法則驗證其致病性時發(fā)現(xiàn)，菌株WS–01較其他菌株致病力減弱，且生長緩慢。用纖維素吸附法提取菌株WS–01的dsRNA，發(fā)現(xiàn)WS–01含有3條1~5 kb的dsRNA條帶，提示W(wǎng)S–01菌株內(nèi)含有dsRNA病毒。利用高溫–利巴韋林–尖端脫毒結(jié)合的方法消除WS–01內(nèi)的病毒，所得菌株WS–01–D與菌株WS–01相比，致病性增強(qiáng)且表型恢復(fù)正常，提示弱毒菌株WS–01的致病力減弱與其所含dsRNA有關(guān)。

匍柄霉屬病菌；弱毒菌株；dsRNA病毒；病毒消除

匍柄霉屬(Wallroth)真菌寄主廣泛，可引起多種作物病害[1–5]。防治匍柄霉葉斑病主要采用化學(xué)方法，殺菌劑多為甲霜·錳鋅、代森錳鋅、福星等，但效果普遍較差[6–7]。長期持續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥易造成環(huán)境污染，并且極易導(dǎo)致病菌形成抗藥性。

真菌病毒是侵染真菌并在真菌中復(fù)制的病毒，廣泛存在于包括植物病原真菌在內(nèi)的各種真菌中[8–9]。目前，報道的真菌病毒主要分為dsRNA和+ssRNA病毒[10–11]。大部分真菌病毒對寄主表現(xiàn)為潛伏侵染，但有小部分真菌病毒引起寄主的不正常表型。弱毒相關(guān)真菌病毒被認(rèn)為是一種潛在的生防因子，可以用來防治植物真菌性病害[12–14]。

筆者從感染葉斑病的萵苣葉片上分離得到4株真菌(WS–01、WS–02、WS–03、WS–04)，ITS序列分析鑒定為匍柄霉。菌株WS–01在PDA培養(yǎng)基上較其他3株匍柄霉生長緩慢，科赫氏法則驗證其致病性時也發(fā)現(xiàn)，接種萵苣葉片后，WS–01致病力較其他菌株弱。用纖維素吸附法提取菌株WS–01的dsRNA，發(fā)現(xiàn)其含有3條1~5 kb的dsRNA條帶。通過病毒消除和弱毒菌株與脫毒菌株的生物學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)菌株WS–01的不正常表型與所含dsRNAs有關(guān)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜基地采集的具有典型葉斑病發(fā)病癥狀的萵苣葉片。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離鑒定與致病力測定

用組織分離法，取葉片病健交界處組織，培養(yǎng)并分離獲得病原菌。用打孔器打取菌餅(直徑4 mm)對健康萵苣葉片進(jìn)行無傷接種，3 d后觀察接種處是否出現(xiàn)葉斑病癥狀。

采用CTAB法[15]提取菌株DNA，利用通用引物ITS4(5–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3)和ITS5 (5–GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG–3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：dNTPs (10 mmol/L) 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，引物(10 μmol/μL ) ITS4和ITS5各1 μL，模板DNA 2 μL，補(bǔ)足ddH2O使體系達(dá)到25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，34個循環(huán)；最后72 ℃10 min補(bǔ)平片段。PCR產(chǎn)物采用1 %瓊脂凝膠電泳檢測，送鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，并通過MEGA5軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2弱毒菌株毒力分析

1) 弱毒菌株dsRNA的提取。將弱毒菌株接于PD培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好的菌絲體用滅菌紗布過濾，收集菌絲，并用滅菌濾紙吸干水分。參照Morris T J和Dodds J A方法[16]進(jìn)行dsRNA的提取。

粗提dsRNA采用DNase I和S1核酸酶去除DNA和ssRNA后，1%瓊脂凝膠電泳，凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

2) dsRNA的消除。將弱毒菌株轉(zhuǎn)接到含有利巴韋林的PDA培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)7 d后，挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)接到同樣含有利巴韋林的培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接4代后，用PD培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，用于dsRNA的提取驗證。

3) 脫毒菌株與弱毒菌株的生物學(xué)特性比較。將弱毒菌株與其脫毒菌株接于PDA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

打取菌餅(直徑4 mm)接于PDA平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后每間隔24 h采用十字交叉法測定記錄1次菌落直徑，每個菌株3次重復(fù)。

采用離體葉片接種法，在PDA平板上活化5 d的菌落邊緣，分別打取直徑為4 mm菌絲塊，對萵苣葉片進(jìn)行無傷接種，每個菌株重復(fù)4次，以空白瓊脂塊作對照，置 28 ℃保濕培養(yǎng)3 d后觀察發(fā)病情況。

2　結(jié)果與分析

2.1 萵苣葉斑病病原菌的生物學(xué)特性

通過組織分離法，從感染葉斑病的萵苣葉片上得到4個純培養(yǎng)的菌株，編號為WS–01、WS–02、 WS–03、WS–04。在PDA培養(yǎng)基上，菌落呈匍匐狀，產(chǎn)生色素。到第7天時，菌株WS–02、 WS–03、 WS–04的菌絲基本可鋪滿整個培養(yǎng)皿(直徑7 cm)，但菌株WS–01生長較慢(2.8 cm)(圖1)。將4個菌株分別接種于健康萵苣葉片，3 d后，WS–02、WS–03、WS–04菌株接種的葉片初現(xiàn)病斑，5 d時在離體的萵苣葉片上形成典型褐色圓形病斑，病斑周圍有黃色暈圈，但接種WS–01的此時才初現(xiàn)病斑(圖2)。

圖1　培養(yǎng)7 d的菌落在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)

圖2　離體接種后5 d萵苣葉片的感病結(jié)果

用真菌rDNA 基因通用ITS4和ITS5引物對4個菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到600 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果顯示，萵苣上分離的病原菌WS–01、WS–02、WS–03、WS–04與、、單獨處于一個分支上，聚為一類。rDNA– ITS序列分析確定4個菌株均為匍柄霉(spp)，但尚無法鑒定到種。

圖3系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3Phylogenetic tree

2.2弱毒菌株的特性

對弱致病力菌株WS–01，采用纖維素CF11吸附法進(jìn)行dsRNA提取，提取物經(jīng)過DNase I和S1 Nuclease去除DNA和ssRNA后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示該菌株內(nèi)含有大小為1~5 kb的dsRNAs(圖4)。

圖4　菌株WS–01的dsRNA電泳圖譜

菌株WS–01采用高溫–利巴韋林–尖端消除方法進(jìn)行平板轉(zhuǎn)接，4代后用纖維素吸附法提取dsRNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，第4代完全消除，命名為WS–01–D(圖5)。

圖5　WS–01–D內(nèi)的dsRNA的電泳圖譜

將弱毒菌株WS–01及脫毒菌株WS–01–D分別接種于PDA平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察菌落及菌絲形態(tài)，結(jié)果(圖6)顯示，WS–01–D菌落邊緣規(guī)則化，生長速度較快，7 d即可基本擴(kuò)展到整個培養(yǎng)皿。WS–01菌絲內(nèi)部囊泡較多。

圖6　WS–01和WS–01–D的菌落及菌絲形態(tài)

比較WS–01和WS–01–D的生長速度發(fā)現(xiàn)，生長速度分別為0.55 cm/d及1.09 cm/d，WS–01–D生長速度明顯快于WS–01。

觀察接種萵苣葉片發(fā)現(xiàn)，接種WS–01基本不發(fā)病，而接種WS–01–D可產(chǎn)生較大病斑，致病性明顯增強(qiáng)，接種3 d時開始形成黃褐色病斑，5 d時病斑直徑達(dá)到1.4 cm左右(圖7)，由此推測WS–01可引起致病力減弱。

圖7　WS–01和WS–01–D的致病力

3　結(jié)論與討論

匍柄霉葉斑病已經(jīng)成為近年來新發(fā)生及流行的一種病害[17]，筆者對感染葉斑病的萵苣葉進(jìn)行了病原菌的分離純化，得到4個純培養(yǎng)菌株WS–01、WS–02、WS–03、WS–04，ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明，這些菌株均為匍柄霉(spp.。匍柄霉在形態(tài)學(xué)鑒定中，多根據(jù)分生孢子的長寬比對匍柄霉屬真菌相似種進(jìn)行區(qū)分[7]，但是在培養(yǎng)中并未發(fā)現(xiàn)孢子，曾經(jīng)采取一系列誘導(dǎo)真菌產(chǎn)孢的方法，都未能得到孢子，因此暫未能鑒定到種。在對菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)和致病力測定時發(fā)現(xiàn)，菌株WS–01與菌株WS–02、WS–03、WS–04相比，生長速度較慢，致病力較弱。

弱毒相關(guān)真菌病毒可引起寄主生長速度變慢，致病力減弱。筆者推測菌株WS–01的弱毒現(xiàn)象與真菌病毒有關(guān)，因此采用纖維素吸附提取法對菌株WS–01進(jìn)行dsRNA提取，發(fā)現(xiàn)其確實含有病毒。

通過高溫–利巴韋林–尖端方法進(jìn)行病毒消除，得到脫毒菌株WS–01–D，并比較了脫毒菌株和弱毒菌株在菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、菌絲生長速度和致病力方面的差異。結(jié)果表明，病毒的存在可以改變寄主的菌落和菌絲形態(tài)及生長速度，甚至引起弱毒現(xiàn)象。真菌病毒引起低毒力的現(xiàn)象有不少報道，原因不盡相同，病毒降低萵苣匍柄霉菌株WS–01致病力的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薛峰．暗色絲孢真菌細(xì)基格孢屬()、匍柄霉屬()及鏈格孢屬()的分類和分子系統(tǒng)學(xué)研究[D]．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．

[2] 張?zhí)煊睿袊婢荆旱谌痪韀M]．北京：科學(xué)出版社，2009：158–177．

[3] Zhou Y F，Shi Y X，Xie X W，et al．Leaf spot of spinach caused bysp．nov[J]. Mycosystema，2011，30(3)：379–383．

[4] 周艷芳，郭英蘭，李寶聚．落葵上匍柄霉一新種[J]．菌物學(xué)報，2012，31(2)：165–167．

[5] Chai A L ，Du G F，Shi Y X，et al．Leaf spot on sweet potato() caused by，a new disease in China[J]．Journal Phytopathology，2015，163：1046–1049．

[6] 李玉中，楊芳，劉春，等．衡陽地區(qū)萵筍葉斑病病原菌的鑒定及其室內(nèi)藥劑篩選[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(2)：102–104．

[7] 鄭露．大蒜白斑病病原學(xué)、防治技術(shù)及其毒素致病病理研究[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．

[8] Ghabrial S A，Suzuki N．Viruses of plant pathogenic fungi[J]．Annu Rev Phytopathol，2009，47：353–384．

[9] Xie J，Wei D，Jiang D，et al．Characteriation of debilitation-associated mycovirus infecting the plant pathogenic fungus[J]．J Gen Virol，2006，87：241–249．

[10] Liu L，Xie J，Cheng J，et al．Fungal negative-stranded RNA virus that is related to bornaviruses and nyaviruses[J]．PNAS，2014，111(33)：12205–12210．

[11] Yu Xiao，Li Bo．Age minivirus-related DNA mycovirus that confers hypovirulenceto a plant pathogenic fungus[J]．PNAS，2010(4)：8387–8392．

[12] Nuss D L．Hypovirulence：mycoviruses at the fungal- plant interface[J]．Nat Rev Microbiol，2005(3)：632– 642．

[13] 鄧小軍，李桂芳，魏穎，等．油菜菌核病菌致病性分化及弱毒現(xiàn)象[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016，42(3)：317–321．

[14] Yu X，Li B，F(xiàn)u Y，et al．Extracellular transmission of a DNA mycovirus and its use as a natural fungicide[J]. PNAS，2013，110：1452–1457．

[15] Roberts R G．sp．nov．on Ya Li pear fruit：From interception to identification[J]．Plant Disease，2005，89 (2)：134–145．

[16] Morris T J，Dodds J A．Isolation and analysis of double stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue[J]．Phytopathology，1979，69：854–858．

[17] 杜公福，周艷芳，石延霞，等．海南省冬季北運蔬菜匍柄霉葉斑病病原的鑒定[J]．植物保護(hù)，2013，39(2)：122–127．

Isolation of the pathogens causing leaf spot of lettuce and analysis of the reason causing the attenuated virulence

Pan Xianting1,2, Lu Xun1,2, Pang Xidan1,2, Gao Bida1,2，Zhou Qian1,2*

(1.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha 410128, China)

Fourstrains were isolated from lettuce with leaf spot disease by tissue isolation method and identified asspp. with ITS sequences analysis. An attenuated strain with debilitated pathogenicity and slower growth rate named WS–01 was found by artifical inoculation. The cellulose CF11 method was used to extract dsRNA to determine the relation between the debilitated pathogenicity and its dsRNA mycovirus, three dsRNAs ranged from 1 kb to 5 kb were detected in the WS–01 strain. High temperature-ribavirin-hyphal tip isolation method for elimination of virus was conducted. The results showed that the pathogenicity of mycovirus-eliminated strain WS–01–D was enhanced and the phenotype returned to normal compared to the original strain, indicating the abnormal phenotype of strain WS–01 was related to its dsRNA.

.; attenuated strain; dsRNA mycovirus; virus elimination

S436.36

A

1007-1032(2016)05-0538-05

2016–03–30

2016–04–13

湖南省大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(XCX16080)

潘顯婷(1991—)，女，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事植物病理學(xué)研究，541879123@qq.com；*通信作者，周倩，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)研究，zhouqian2617@hunau.edu.cn

投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維