曾東，馮帆，卿小丹，倪學(xué)勤*，孫豪，邱賢猛，鄒芙沁，楊明月，朱星星，張紫媛，羅顯進(jìn)

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小型犬蓄膿子宮摘除對其陰道和糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響

曾東1,2，馮帆1#，卿小丹1，倪學(xué)勤1,2*，孫豪1，邱賢猛3，鄒芙沁1，楊明月1，朱星星1，張紫媛1，羅顯進(jìn)1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都 611130；3.四川成都博愛寵物醫(yī)院，四川成都 611100)

選取4只子宮蓄膿的小型犬，分別取其陰道樣品和糞便樣品，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)–變性梯度凝膠電泳(PCR–DGGE)技術(shù)，回收共性及特異性條帶進(jìn)行克隆測序，分析小型犬蓄膿子宮摘除對其陰道及糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示：在摘除患犬子宮的前1 天、摘除子宮后治療第1天和第2天，患犬陰道菌群的多樣性指數(shù)分別為3.22、3.35、3.05，均勻度分別為0.88、0.92、0.83，豐富度分別為25.0、28.50、21.25，均呈先增加后降低的趨勢，而糞便菌群只有豐富度呈先增加后降低的趨勢；大腸桿菌、假單胞菌是陰道和糞便的共同優(yōu)勢菌群，紅球菌是共有的特異性細(xì)菌，而葡萄球菌、嗜水氣單胞菌是陰道的特有細(xì)菌，不動桿菌是糞便的特有細(xì)菌。結(jié)果表明，小型犬蓄膿子宮摘除對陰道菌群結(jié)構(gòu)影響較大，陰道內(nèi)的大腸桿菌及假單胞菌可能源于糞便。

小型犬；子宮蓄膿；陰道菌群；腸道菌群

子宮蓄膿(pyometra)是由子宮內(nèi)膜增生并繼發(fā)化膿性感染而引發(fā)的子宮內(nèi)膜炎，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)蓄積大量膿液及嚴(yán)重的全身癥狀，分為開放型和閉鎖型[1]，多見于6歲以上母犬及發(fā)情后第4～8周內(nèi)未經(jīng)產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)后屢配不孕的中、老齡犬[2]。京巴、博美、西施等小型犬易發(fā)該病[3]。在臨床上，該病是發(fā)病率最高的母犬產(chǎn)科疾病，一般以手術(shù)摘除子宮、卵巢為主進(jìn)行治療，治愈率較高[4]。子宮蓄膿是由細(xì)菌和激素共同作用導(dǎo)致的，也受年齡、生殖內(nèi)分泌變化等因素的影響[5]。在發(fā)情期，子宮內(nèi)膜受孕酮激素刺激后發(fā)生的腺囊性增生易導(dǎo)致細(xì)菌感染。子宮蓄膿的常見感染菌是大腸桿菌，此外還有葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌、變形桿菌、氣桿菌等[6]。關(guān)于這些細(xì)菌的來源及其與陰道菌群和糞便菌群關(guān)系的研究尚少。筆者選擇四川成都博愛寵物醫(yī)院犬子宮蓄膿病例，采用PCR–DGGE技術(shù)結(jié)合特異性條帶的克隆測序，分析手術(shù)切除蓄膿子宮對陰道及糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響，旨在為小型犬子宮蓄膿的防治提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗動物

試驗動物為4只年齡6歲以上患子宮蓄膿的小型犬，平均體質(zhì)量7.6 kg。病例采自四川成都博愛寵物醫(yī)院。

1.2儀器和試劑

PCR引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成；2×MasterMix(含染料)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；銀染藥品和試劑購自四川瑞進(jìn)特科技有限公司；Gel Extraction Kit購自美國OME–GA公司；pMD19–T 載體購自寶生物工程(大連)有限公司。MJ Research PTC–200 PCR儀為美國Bio–Rad公司產(chǎn)品；DGGE電泳儀為Dcode Universal Detection System(Bio–Rad(加拿大))；核酸濃度測定儀為ND–1000 UV–Vis Spectro-Photometer (美國Nano-Drop公司)；凝膠成像系統(tǒng)為Gs800 Cali-Brated Densitometer(美國Bio–Rad公司)。

1.3樣品采集

分別用滅菌棉球蘸取4只患犬摘除子宮前1 d和摘除子宮后治療第1天、第2天的陰道樣和糞樣，分別置于裝有生理鹽水的1.5 mL EP管中，每只犬陰道樣及糞樣各3個，根據(jù)采樣時間的先后，1號犬3次陰道樣編號為Y1、Y2、Y3，2號犬編號為Y4、Y5、Y6，3號犬編號為Y7、Y8、Y9，4號犬編號為Y10、Y11、Y12；糞樣編號方法相同，編為F1～F12，共24個樣品，置–80 ℃冰箱保存，備用。

1.4細(xì)菌總DNA的提取

采用酚/氯仿/異戊醇抽提、異丙醇沉淀獲得樣品細(xì)菌總DNA[7]，測定濃度后置于–20 ℃冰箱保存，備用。

1.516S rDNA V3 區(qū)域的PCR擴(kuò)增及檢測

采用細(xì)菌16S rRNA基因V3片段(339~539 bp)設(shè)計合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游帶GC發(fā)夾引物為5′–CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG T–3′，下游引物為5′–GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C–3′[8]。擴(kuò)增體系25 μL：2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.0 μL，用ddH2O補足25 μL。同時設(shè)置陰性對照。PCR 擴(kuò)增程序為95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物。

1.6PCR–DGGE指紋圖譜分析

參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行PCR–DGGE凝膠電泳分析。凝膠電泳梯度為35%~65%(100%的變性劑包括7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，變性方向與電泳方向一致。采用1×TAE作電泳緩沖液，于100 V、60 ℃條件下電泳14~16 h，結(jié)果經(jīng)硝酸銀染色后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.7共性及特異性條帶的回收及克隆測序

將DGGE圖譜上的共性條帶和特異性條帶分別割膠回收，并浸泡在30 μL加有0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X–100)的緩沖液中，4 ℃放置2 d。取1 μL作為模板，按1.5中的方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)(不帶GC夾子的引物)，用2%瓊脂糖凝膠檢測，膠回收試劑盒回收DNA。采用pMD?19–T Vector試劑盒，參照使用手冊對模板PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，采用藍(lán)白斑篩選出陽性克隆子，每個條帶選取3個陽性克隆送公司測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，確定親緣關(guān)系最近的細(xì)菌。

1.8數(shù)據(jù)分析

用如下公式計算多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)、均勻度(evenness)和豐富度(richness)。；=/max；=。式中：為物種的相對豐度比例；max為當(dāng)為所有樣品總物種數(shù)時的多樣性指數(shù)；為樣品在DGGE 的條帶數(shù)。

將DGGE圖譜數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化后得到圖譜中條帶遷移位置數(shù)字化矩陣導(dǎo)入SPSS 22.0軟件和NTSYS 2.1軟件進(jìn)行主成分分析及聚類分析。

2　結(jié)果與分析

2.1陰道及糞樣細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū) PCR– DGGE圖譜分析

如圖1、圖2所示，患犬摘除蓄膿子宮前1 d和摘除子宮后期治療的第1天、第2天，陰道和糞便細(xì)菌的PCR–DGGE圖譜中均產(chǎn)生了較為豐富的電泳條帶，強的電泳條帶反映了陰道和糞便中的優(yōu)勢菌群，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性代表細(xì)菌菌群的多樣性。陰道樣品平均條帶數(shù)為25條，略低于糞便樣品的(27條)。摘除子宮后第1天的陰道及糞便菌群豐富度大多高于摘除前的，且陰道菌群豐富度在同一時間段的不同個體中無明顯差異，而在同一個體的不同階段有顯著差異，呈現(xiàn)摘除子宮后第1天的陰道菌群豐富度較摘除前1 d的增加、摘除第2天的較摘除前1 d減少的趨勢，而糞便菌群豐富度摘除前后變化較小。結(jié)果表明，摘除子宮及摘除子宮后的后期治療對陰道菌群結(jié)構(gòu)的影響較大，對糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響較小。

1，2，3，…，12分別對應(yīng)樣品編號Y1，Y2，Y3，…，Y12；圖中箭頭所指為回收片段。

1，2，3，…，12分別對應(yīng)樣品編號F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，…，F(xiàn)12；圖中箭頭所指為回收片段。

2.2PCR–DGGE圖譜的多樣性分析

對各樣品條帶的數(shù)量、亮度及分布位置進(jìn)行分析的結(jié)果(表1)表明，摘除子宮后1 d陰道菌群的多樣性指數(shù)、均勻度、豐富度均高于摘除子宮前1 d的和摘除子宮后第2天的，表明摘除子宮后第1天的陰道樣品菌群結(jié)構(gòu)的多樣性、均勻度及豐富度均較摘除子宮前1 d和摘除子宮后第2天的高，且均呈先增加后降低的趨勢；糞便菌群的豐富度也有相似變化趨勢，但變化程度較小，且其余指標(biāo)值在摘除子宮前后變化不明顯。

表1　不同樣品采集階段陰道和糞便樣品的多樣性指數(shù)和均勻度及豐富度

2.3PCR–DGGE圖譜條帶的聚類分析

圖3結(jié)果顯示，除陰道樣品Y7外，11個陰道樣品和12個糞便樣品各聚集成一類，不同患犬陰道及糞便菌群的相似性系數(shù)均高于0.63，表明動物個體的差異對其陰道及糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響較小。在陰道樣品中，摘除子宮前Y1、Y4、Y10的相似性系數(shù)為0.88，而與Y7的差異顯著；摘除子宮后第2天，Y6、Y9、Y12的相似性系數(shù)高達(dá)0.95；同一只患犬不同階段的相似性系數(shù)不同，如Y10、Y11、Y12的相似性系數(shù)為0.70，而Y1、Y2、Y3的相似性系數(shù)低至0.65?？梢姡粋€體摘除子宮前后階段的相似性較低，隨著摘除子宮后治療時間的增加，不同患犬間陰道菌群的相似性增大。在糞便樣品中，同一階段的樣品，如F1、F4、F7的相似性系數(shù)為0.74，與F10差異顯著，摘除子宮后第1天、第2天樣品的相似性系數(shù)分別為0.66、0.69，同一只患犬的不同階段如Y4、Y5、Y6的相似性系數(shù)為0.70，Y10、Y11、Y12的相似性系數(shù)低至0.66，可見，摘除子宮前后同一個體及不同個體間糞便菌群結(jié)構(gòu)的相似性均低于陰道菌群結(jié)構(gòu)的，表明摘除子宮對陰道菌群的影響較大。

圖3　PCR–DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果

2.4 PCR–DGGE圖譜條帶的主成分分析

主成分因子1(PCA1)的貢獻(xiàn)率為18.301%，主成分因子２(PCA2)的貢獻(xiàn)率為14.674%；PCA1明顯地將樣品分成2個部分，陰道樣品主要分布在圖的左邊，糞便樣品主要分布在圖的右邊。PCA2將摘除子宮前1 d和摘除子宮后第1天的陰道樣品同摘除子宮后第2天的陰道樣品區(qū)別開來，摘除子宮前1 d及摘除子宮后第1天的樣品主要分布在圖的上邊，摘除子宮后第2天的樣品主要分布在圖的下邊，而糞便樣品呈無規(guī)律性分布(圖4)。

圖4　PCR–DGGE圖譜條帶的主成分分析結(jié)果

2.5條帶測序結(jié)果

PCR–DGGE圖譜顯示，糞便樣品回收了9條帶，陰道樣品回收了12條帶，共回收了21條帶(圖1和圖2中的箭頭所指)。由克隆測序后在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析的結(jié)果(表2、表3)可見，假單胞菌()、大腸桿菌()是陰道和糞便中共同存在的優(yōu)勢菌群，紅球菌()是陰道和糞便中均存在的特異性菌群，而葡萄球菌()、嗜水氣單胞菌()源自陰道，不動桿菌()源自糞便。21個測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的同源性絕大多數(shù)都達(dá)到了100%，說明試驗中所得序列與已鑒定微生物的親緣性高。

表2　陰道樣品PCR–DGGE圖譜的共性和特異性條帶的Blast分析結(jié)果

表3　糞便樣品PCR–DGGE圖譜的共性和特異性條帶的Blast分析結(jié)果

3　結(jié)論與討論

采用PCR–DGGE技術(shù)分析摘除蓄膿子宮對小型犬陰道及糞便菌群的影響，揭示患犬陰道及糞便細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果顯示，患犬陰道和糞便菌群都有較高的豐富度，陰道樣品平均有25條帶，糞便樣品平均有27條帶，患犬陰道菌群的豐富度與糞樣的相當(dāng)；主成分分析結(jié)果顯示，不同患犬摘除子宮前后3個時間點的陰道樣品各自聚為一類，且各類之間分界明顯，而糞便樣品呈不規(guī)則分布，表明不同犬只個體的陰道菌群患子宮蓄膿后表現(xiàn)出一定的相似性，在摘除子宮用相同藥物治療后，相似性程度進(jìn)一步增加，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，而糞便菌群只有豐富度呈現(xiàn)相同的變化趨勢，其余指標(biāo)均在摘除子宮后增加。該現(xiàn)象可能是因為患犬抵抗力下降，腹腔切除子宮導(dǎo)致手術(shù)刺激或感染，使陰道及糞便中菌群的豐富度均增加，但經(jīng)2 d治療后陰道菌群受到抑制，多樣性指數(shù)減少；糞樣菌群受藥物的影響較小，菌群多樣性稍有增加，但變化不明顯。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報道的結(jié)果基本一致(當(dāng)受到藥物或病理因素影響時，腸道移行肌電復(fù)合波會出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致腸道清除運動受到破壞，此時腸道細(xì)菌繁殖速度大于清除速度，細(xì)菌數(shù)量增加)。

本試驗結(jié)果顯示：犬類在患子宮蓄膿的情況下，其陰道微生物的豐度有顯著提高，與糞便微生物的豐度相當(dāng)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[11]報道結(jié)果基本一致(陰道疾病患者陰道微生物群落的豐度和相對豐度均顯著提高[11])。

本試驗結(jié)果顯示：大腸桿菌、假單胞菌是患犬陰道和糞便中共同的優(yōu)勢菌群，紅球菌是共有的特異性細(xì)菌，而葡萄球菌、嗜水氣單胞菌是陰道的特有細(xì)菌；不動桿菌是糞便的特有細(xì)菌。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[12–15]報道的結(jié)果基本一致(子宮蓄膿的主要致病菌為大腸桿菌，細(xì)菌主要來源是陰道彎窿內(nèi)的常在菌，另外還有尿道感染或腸道細(xì)菌移行等其他來源[12]；尿道致病性大腸桿菌是導(dǎo)致子宮蓄膿和泌尿道感染的主要細(xì)菌，其作用機理是因其具有特殊的尿道感染致病因子(uropathogenic virulence factors，UVFs)，UVFs幫助細(xì)菌吸附、定植于尿道和子宮黏膜，為細(xì)菌的生長繁殖提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，尿道中的細(xì)菌在發(fā)情期的某個易感染階段進(jìn)入并感染子宮[13]；從子宮樣品中可分離出鏈球菌、克雷伯菌、葡萄球菌、巴斯德菌、變形桿菌和假單胞菌等常見菌[14])。

本試驗中檢測到的陰道優(yōu)勢菌群是大腸桿菌和假單胞菌，二者均為革蘭氏陰性菌，表明子宮蓄膿對陰道菌群的影響較大。正常情況下，陰道菌群主要為陰道桿菌及革蘭氏陽性球菌等[15]，只有當(dāng)機體免疫力低下或陰道內(nèi)環(huán)境改變時，陰道內(nèi)酸堿度才發(fā)生變化，導(dǎo)致病原菌大量繁殖。

在陰道和糞便PCR–DGGE圖譜中，大腸桿菌、假單胞菌電泳條帶的強度和遷移率均相似。陰道和糞便中大腸桿菌、假單胞菌的DNA序列通過BLAST比對和同源性分析，可得大腸桿菌的值為9e–82，假單胞菌的值為2e–68，二者都接近于0，表明陰道和糞便中的大腸桿菌和假單胞菌有很高的相似性。這是因為犬發(fā)情后子宮內(nèi)膜脫落，出血，生殖道抵抗力降低，此時如果犬坐于地面往往會因為陰部被地面微生物污染而引發(fā)子宮蓄膿[16](犬坐于附有自身糞便的地面時會通過細(xì)菌移行感染糞便中的大腸桿菌和假單胞菌)。

綜合分析結(jié)果表明，子宮蓄膿對陰道菌群影響較大；隨著摘除子宮后時間的增加，陰道菌群的多樣性呈先增加后降低的趨勢；陰道內(nèi)的大腸桿菌及假單胞菌可能來源于糞便。

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Effects of purulent uterus extirpation on the microflora in vagina and feces of small canine

Zeng Dong1,2，F(xiàn)eng Fan1，Qing Xiaodan1，Ni Xueqin1,2*，Sun Hao1，Qiu Xianmeng3，Zou Fuqin1，Yang Mingyue1，Zhu Xingxing1，Zhang Ziyuan1，Luo Xianjin1

(1.Institute of Animal Microecology College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu 611130, China; 3.Sichuan Chengdu Bo’ai Animal Hospital, Chengdu 611100, China)

Four small canines, suffered from pyometra, were employed to test the effects of uterus extirpation on the microbial community structure in their vagina and feces. The recycled common and specific bands derived from samples in vagina and feces were sequenced and cloned by adopting polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis (PCR–DGGE) technologies. The results showed that the diversity index, evenness and richness of flora in vagina were 3.22, 3.35 and 3.05, respectively before the extirpation; they were 0.88, 0.92, and 0.83 respectively after the first extirpation day and 25.0, 28.50, and 21.25 respectively after the second extirpation day, which showed an decrease at first, and then increase at the second day. To the flora that in feces, on the contrast, only the richness showed the same tendency.andwere the dominant flora both in vagina and feces,presented in specific both in vagina and feces, whileandpresented specific only in vagina, andwere specific in feces. All the results indicated that uterus extirpation exerted a great impact on microbial community structure in vagina,andin vagina might be derived from feces.

small canine; pyometra; vaginal flora; intestinal flora

S858.292

A

1007-1032(2016)05-0528-06

2015–09–17

2016–09–08

四川省科學(xué)技術(shù)廳科技支撐項目(2013NZ0042)

曾東(1961—)，男，四川丹棱人，博士，教授，主要從事動物微生態(tài)研究，zend@sicau.edu.cn；#共同第一作者，馮帆，主要從事微生態(tài)研究，931540340@qq.com；*通信作者，倪學(xué)勤，博士，教授，主要從事動物微生態(tài)研究，xueqinni@foxmail.com

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