張先成，甄濤，于盛竹，曲娟娟，于德水

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

EYFP基因?qū)氪蠖垢鼍こ叹甑臉?gòu)建

張先成1，甄濤1，于盛竹2，曲娟娟2，于德水1

（1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030）

將黃色熒光蛋白基因（EYFP）整合到質(zhì)粒pBBR1MCS-2上，構(gòu)建pBBR1MCS-2-EYFP，通過三親本雜交的方法，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到HW-05中，獲得含有黃色熒光蛋白的根瘤菌菌株。

熒光蛋白基因；大豆根瘤菌；三親本雜交

20世紀(jì)以來，分子生物學(xué)技術(shù)高速發(fā)展，隨著標(biāo)記基因的出現(xiàn)，通過基因標(biāo)記評(píng)價(jià)根瘤菌的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力更為快捷和準(zhǔn)確。目前，廣泛應(yīng)用的標(biāo)記基因有發(fā)光酶基因、紅色熒光蛋白基因和綠色熒光蛋白基因。黃色熒光蛋白基因（Enhanced Yellow Fluorescent Protein gene，EYFP）是GFP增強(qiáng)型熒光基因，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物和微生物的標(biāo)記研究。通過本項(xiàng)研究，將熒光蛋白基因?qū)肱c我省主栽大豆品種匹配度較高的，為深入研究根瘤菌在土壤和作物根部定殖研究以及根瘤菌的固氮機(jī)制做了鋪墊性預(yù)研工作，為更加充分揭示根瘤菌固氮機(jī)理研究做了基礎(chǔ)性工作。

1　材料與方法

1.1供試菌株和質(zhì)粒

慢生型大豆根瘤菌HW-05（Bradyrhizobium japonicum）為本研究室分離并保存的慢生型大豆根瘤菌。大腸桿菌（E.coli）DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pBBR1MCS-2（KmR）和pRK2013（KmR）均由西班牙塞維利亞大學(xué)生物系Jose教授惠贈(zèng)。

1.2PCR擴(kuò)增引物

表1　引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3各種酶制劑及試劑盒

實(shí)驗(yàn)中所使用的各種限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶等購自Promega、TaKaRa、NEB等生物工程公司；PlasmidminiKit（50）購自O(shè)MEGA公司；DNA Purification Kit（50）購自O(shè)MEGA公司。

1.4培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL。

TY培養(yǎng)基：酵母粉3g，胰蛋白胨5g，CaCl20.87g，瓊脂20g，蒸餾水1 000mL。

2　試驗(yàn)方法

2.1EYFP基因的克隆

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2載體共有的HindⅢ和BamHⅠ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，回收EYFP產(chǎn)物與pBBR1MCS-2進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α。送予上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2HW-05重組子的篩選與鑒定

以構(gòu)建的突變株菌液為模板，分別以EYFP（F）和EYFP（R）為引物，驗(yàn)證HW-05重組子染色體上是否外源基因EYFP。

3　結(jié)果與分析

3.1重組載體pBBR1MCS-2-EYFP的構(gòu)建結(jié)果

利用EYFP基因和pBBR1MCS-2載體共有的HindⅢ和BamHⅠ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后連接，結(jié)果如圖1所示，出現(xiàn)一條特異性條帶，其大小約為5.9kb左右，再經(jīng)酶切驗(yàn)證后可以初步確定EYFP基因已經(jīng)正確的插入到pBBR1MCS-2載體上。

圖1　EYFP與pBBR1MCS-2轉(zhuǎn)化后提取結(jié)果M：DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2連接后轉(zhuǎn)化提取結(jié)果Fig.1 The resultof EYFP/pBBR1MCS-2 transform ationM:DNAMarker DL10000 1:EYFP/pBBR1MCS-2 extraction result

3.2基因工程菌株的構(gòu)建結(jié)果

利用PCR擴(kuò)增EYFP基因，結(jié)果如圖2所示，條帶一條特異性條帶，其大小約為700bp左右，說明EYFP基因存在于基因組之中。

圖2　重組子篩選M：DNAMarker DL100001:HW-05中EYFP基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Screen the candidate M:DNAMarker DL100001-:PCR am plication resulto f EYFP gene in HW-05

4　結(jié)語

我省是全球野生大豆資源豐富的地區(qū)，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力強(qiáng)但固氮能力弱，接種根瘤菌會(huì)影響結(jié)瘤率，接種效果十分不理想，進(jìn)而制約了根瘤菌菌劑在我省的推廣應(yīng)用。篩選高效結(jié)瘤能力的根瘤菌迫在眉睫，經(jīng)過我所多年研究，分離獲得的根瘤菌HW-05與我省主栽大豆品種具有極強(qiáng)的親和關(guān)系，具備發(fā)展為優(yōu)良根瘤菌菌劑的潛質(zhì)。隨著研究的不斷深入，科學(xué)地準(zhǔn)確評(píng)價(jià)根瘤菌結(jié)瘤競(jìng)爭(zhēng)能力又是根瘤菌制劑應(yīng)用于實(shí)際的技術(shù)關(guān)鍵。

［1］任嘉紅，劉輝，姜楠，等.GFP標(biāo)記溶磷草木樨中華根瘤菌CHW10B及其定殖［J］.林業(yè)科學(xué)，2015，（01）：74-79.

［2］張淑卿，李劍峰，陳力玉，等.苜蓿根瘤菌cfp熒光標(biāo)記株的構(gòu)建及篩選方法［J］.草業(yè)科學(xué)，2015，（05）：711-718.

［3］陳力玉.基于三親本雜交的熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建及其穩(wěn)定性檢測(cè)研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［4］劉曉燕.應(yīng)用紅色熒光蛋白標(biāo)記研究酸脅迫下苜蓿——根瘤菌共生過程［D］.重慶：西南大學(xué)，2014.

［5］肖文麗，關(guān)大偉，李俊，等.采用gfp和rfp基因標(biāo)記評(píng)價(jià)大豆根瘤菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力［J］.大豆科學(xué)，2010，（03）：366-369.

［6］史巧娟.綠色熒光蛋白基因gfp在華癸中生根瘤菌與紫云英共生固氮體系研究中的應(yīng)用［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000.

［7］劉楨付.費(fèi)氏中華根瘤菌的基因標(biāo)記與競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001.

［8］王浩，繩志雅，隋新華，等.用gfp基因標(biāo)記法研究大豆根瘤菌在大豆根部定殖結(jié)瘤情況［J］.微生物學(xué)雜志，2006，（02）：1-4.

Construction of EYFP gene into engineered strain of Rhizobium

ZHANG Xian-cheng1，ZHEN Tao1，YU Sheng-zhu2，QU Juan-juan2，YUDe-shui1
（1.Istitute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010 China；2.School of Resourcesand Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Integrating theyellow fluorescentprotein（EYFP）intoplasmid pBBR1MCS-2 to constructpBBR1MCS-2-EYFP，and through themethod of tri-parentalhybridization，the constructed carrierwas transformed into HW-05，so as to obtain Rhizobium strains containinga yellow fluorescent protein.

Fluorescent protein gene；Soybean Rhizobium；Triparental hybridization

S144.5

A

1674-8646（2016）18-0008-02

2016-08-08

于德水（1969-），男，黑龍江哈爾濱人，研究員，從事大豆根瘤菌研究。