高學(xué)軍，李姍姍，于萌萌，李冬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱　150030）

牛NF-κB1基因的原核表達(dá)與蛋白純化

高學(xué)軍，李姍姍，于萌萌，李冬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱150030）

NF-κB1是一類重要核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因表達(dá)調(diào)控。NF-κB1能與奶牛乳腺中乳合成調(diào)控相關(guān)基因結(jié)合，發(fā)揮泌乳調(diào)節(jié)作用。研究應(yīng)用PCR方法擴增奶牛NF-κB1基因編碼序列，通過Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位點將其定向插入pGEX-4T-1載體中，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-NF-κB1，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21 （DE3）。經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）大量誘導(dǎo)表達(dá)，8 mol·L-1尿素裂解包涵體，裂解后上清經(jīng)GST-Sepharose 4B親和純化，SDS-PAGE和Western blotting鑒定。結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-NF-κB1構(gòu)建成功，SDS-PAGE證實NF-κB1融合蛋白存在于包涵體內(nèi)，純化后得到GST-NF-κB1融合蛋白，為進一步研究NF-κB1蛋白在奶牛泌乳中作用提供試驗依據(jù)。

奶牛；NF-κB1；克?。辉吮磉_(dá)；純化

高學(xué)軍，李姍姍，于萌萌，等.牛NF-κB1基因的原核表達(dá)與蛋白純化［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，47（9）：33-38.

Gao Xuejun，Li Shanshan，Yu Mengmeng，et al.Prokaryotic expression and protein purification of gene bovineNF-κB1［J］. Journal of Northeast Agricultural University，2016，47（9）：33-38.（in Chinese with English abstract）

NF-κB（Nuclear transcription factor-kappa B）是一類重要核轉(zhuǎn)錄因子，多種信號傳導(dǎo)途徑匯聚點［1］。其不僅參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡和增殖等多種基因的表達(dá)調(diào)控，且與腫瘤發(fā)生及炎性相關(guān)疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)［2-5］。NF-κB家族主要包括NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、Rel A（p65）、Rel B及c-Rel等，大部分可相互結(jié)合成同源/異源二聚體。最常見是p65 與p50組成的異二聚體，含量最多、功效最大［6-7］。

當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、B細(xì)胞抗原受體（B cell receptor，BCR）的同源抗原、T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的同源抗原與氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)活化，一系列信號級聯(lián)反應(yīng)活化IκB蛋白激酶（IκB kinase，Iκκ）復(fù)合物，IκB磷酸化和泛素化，在蛋白酶體作用下降解，釋放與之結(jié)合的NFκB，最終NF-κB轉(zhuǎn)錄因子進入細(xì)胞核并與靶基因啟動子結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，這些靶基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及免疫細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化和調(diào)亡［8-9］。

本研究前期發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Bovine mammary epithelial cells，BMECs）中，NF-κB1與mTOR、STAT5、CSN2等基因啟動子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控乳蛋白合成［10］。pGEX-4T-1是表達(dá)GST融合蛋白原核高效表達(dá)載體，存在IPTG誘導(dǎo)啟動子，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物在N端存在GST序列，融合蛋白產(chǎn)物可通過GST層析柱快速、簡便純化，進行后續(xù)蛋白質(zhì)相互作用、結(jié)構(gòu)分析等研究。為深入研究NF-κB1在奶牛乳腺泌乳中信號調(diào)節(jié)作用，本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-NF-κB1，在大腸埃希氏菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)、純化融合蛋白，為研究其在乳腺中泌乳調(diào)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1載體和細(xì)胞

載體pGEX-4T-1和大腸埃希氏菌BL21（DE3）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室提供；奶牛乳腺上皮細(xì)胞樣品取自哈爾濱市雙城區(qū)連發(fā)屠宰場，健康泌乳期中國荷斯坦奶牛，牛被放血宰殺后，常規(guī)手術(shù)取乳腺組織，組織塊法分離BMECs，經(jīng)純化培養(yǎng)后于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

TRIzol RNA提取試劑購于Life technologies，In?vitrogen公司（美國）；Prime ScriptTMRT reagent kit、Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶（Eco RⅠ、XhoⅠ）、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA Marker（DL5000、DL10000）購于TaKaRa公司（大連）；引物片段合成及核酸測序均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司完成；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量試劑盒購于Axygen生物技術(shù)公司（美國）；GST抗體購于碧云天生物技術(shù)有限公司（北京）；NF-κB1抗體購于Cell Signaling Technology（CST）公司（美國）；HRP標(biāo)記的二抗購于中杉金橋生物技術(shù)有限公司（北京）；ECL試劑購于普利萊基因技術(shù)有限公司（北京）；GST Microspin Purification kit購于中科晨宇生物科技公司（北京）；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一）；Nano-Drop 2000超微量分光光度計（Thermo，美國）；PowerLook 2100XL掃描儀（Umax公司，韓國）；DYCZ-23A型穩(wěn)壓電泳槽（六一，北京）；空氣浴振蕩器（HZQ-C型，哈爾濱東明）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀）；凝膠成像系統(tǒng)（GDS-8000，UVP，美國）；PCR儀（T-Gradient 96 Thermoblock Modul，Biometra）；恒溫金屬浴（CHB-100，杭州博日）；冷凍離心機（Z300-K，德國HERMLE）。

1.3方法

1.3.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

純化后BMECs用含10%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)至90%單層匯合時，收集細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。Nano-Drop 2000檢測RNA濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA質(zhì)量。根據(jù)Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.2NF-κB1全長編碼區(qū)基因擴增

根據(jù)NCBI上公布的牛NF-κB1基因mRNA序列（GI：115497301），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計1對可用于序列擴增的專一性引物。上游引物：5'CGGAATTCATGGCAGAAGACGACCCGTAT TT 3'，下游引物：5'CCGCTCGAG AATTTTGCCTT CTATAGGTCCTTCC 3'，擴增片段長度2 909 bp。以BMECs的cDNA為模板作PCR擴增。建立25 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸2.5 min，32次循環(huán)后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，膠回收試劑盒回收約2 909 bp的PCR產(chǎn)物。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化得到目的片段。

1.3.3pGEX-4T-1-NF-κB1表達(dá)載體構(gòu)建

將pGEX-4T-1載體和膠回收后的NF-κB1 PCR產(chǎn)物分別用Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳檢測并分別回收目的片段，T4DNA連接酶于恒溫金屬浴16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過夜，以primer-NF-κB1引物作PCR鑒定，陽性克隆按1%比例擴大培養(yǎng)，擴增后提取質(zhì)粒，用Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，測序驗證。

1.3.4重組蛋白在原核細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體變性溶解

將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-NF-κB1陽性克隆及pGEX-4T-1空載體接種到含有100 μg·mL-1氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，將菌液按1∶50接種到含有10 μg·mL-1氨芐青霉素50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600達(dá)0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h［11］。同時對含GST蛋白的pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG終濃度為1 mmol·L-1，設(shè)為對照。誘導(dǎo)后的菌液在4℃、5 000 r·min-1離心10 min后收集菌體，加入1 mL細(xì)菌裂解液充分重懸，室溫孵育10 min，反復(fù)凍融（-80℃10 min，37℃快速融解）3次，冰上超聲破碎，超聲條件為：5 s超聲，5 s間歇，30 min超聲。超聲破碎后菌液4℃10 000 r·min-1離心10 min，收集上清及粗包涵體沉淀。按質(zhì)量體積比1/40，向粗包涵體中加入PBS（含1%Trition X-100）緩沖溶液洗滌沉淀，重復(fù)洗滌3次。然后向沉淀中分別加入適量8 mol·L-1尿素，4℃繼續(xù)裂解，收集上清。分別取20 μL菌液上清及裂解沉淀后上清與上樣緩沖液1∶1混合，沸水煮10 min，超聲3次，每次15 s，樣品SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色2 h，37℃脫色液脫色2 h，檢測誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.3.5融合蛋白GST-NF-κB1純化

將誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定正確的剩余上清與500 μL PBS重懸的GST-Sepharose 4B小顆粒4℃顛倒混勻4 h，3 000 r·min-1低速離心收集GST-Sepharose 4B小顆粒，500 μL PBS洗脫3次，除去未結(jié)合蛋白質(zhì)，利用還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液少量多次洗脫珠子上GST-NF-κB1，收集樣品。一部分SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測純化結(jié)果，另一部分作Western blotting初步檢測。4℃75 V恒壓轉(zhuǎn)移至NC膜上2 h，用含5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，分別加入GST抗體（1∶500），4℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色，拍照。

1.3.6目的蛋白鑒定

將IPTG誘導(dǎo)的GST-NF-κB1與一次過柱、二次過柱純化后GST-NFκB1融合蛋白作8%SDSPAGE電泳，利用特異性NF-κB1抗體作Western blotting分析。

2　結(jié)果與分析

2.1NF-κB1基因克隆

以BMECs細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴增NF-κB1基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見特異性片段大小約2 909 bp（見圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1　PCR擴增NF-κB1基因Fig.1PCR amplification of NF-κB1 gene

2.2重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-NF-κB1構(gòu)建與測序

將NF-κB1基因的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體連接、轉(zhuǎn)化，擴大培養(yǎng)后得到陽性克隆pGEX-4T-1-NF-κB，Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切后分別得到兩條清晰條帶，分別約為2 909 bp處NF-κB1基因和4 969 bp處pGEX-4T-1載體（見圖2），與預(yù)期結(jié)果相符。測序結(jié)果顯示插入片段為2 909 bp，與NCBI公布的NF-κB1基因mRNA序列完全匹配，兩者同源性100%，且含有pGEX-4T-1質(zhì)粒序列，證明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-NF-κB1構(gòu)建成功。

2.3融合蛋白GST-NF-κB1誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

利用IPTG分別對pGEX-4T-1-NF-κB1重組載體及含有GST蛋白的pGEX-4T-1空載體作誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NF-κB1表達(dá)的蛋白在上清中含量較少，主要以包涵體形式存在。采用8 mol·L-1尿素溶解沉淀，收集上清，作SDS-PAGE電泳分析?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明，132 ku處存在大量目的蛋白表達(dá)，上清中目的蛋白條帶處表達(dá)量較少，而沉淀中存在大量融合蛋白。8 mol·L-1尿素溶解包涵體上清中，目的條帶處融合蛋白含量較多，可進一步純化。

圖2　重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-NF-κB1酶切鑒定Fig.2Identification of recombination plasmid pGEX-4T-1-NF-κB1 by restriction enzyme digestion of XhoⅠand Eco RⅠ

圖3　GST-NFκB1融合蛋白包涵體破碎后產(chǎn)物SDS-PAGE電泳鑒定Fig.3SDS-PAGE result of recombinant protein GST-NFκB1 in the cracked inclusions

2.4融合蛋白GST-NF-κB1純化

用GST-Sepharose 4B親和珠純化得到融合蛋白，還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液少量多次洗脫，收集洗脫液，利用GST標(biāo)簽單克隆抗體作Western blotting分析。

結(jié)果顯示，作為對照的空載體表達(dá)產(chǎn)物在目的蛋白位置未檢測到免疫信號；經(jīng)誘導(dǎo)的包涵體上清中及過柱純化后洗脫液中蛋白在132 ku（目的蛋白分子質(zhì)量與標(biāo)簽載體分子質(zhì)量之和）處均能被兔抗GST單抗特異性識別，表明純化蛋白極可能為GST-NF-κB1融合蛋白（見圖4A）?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果也表明，在目的蛋白位置出現(xiàn)陽性條帶。但經(jīng)一次過柱純化的蛋白雜帶較多，二次純化后的融合蛋白在目的條帶處僅一條單鏈，且無雜帶（見圖4B、C）。

2.5目的蛋白鑒定

為進一步確定上述誘導(dǎo)純化蛋白即GST-NF-κB1融合蛋白，利用特異性NF-κB1抗體作West?ern blotting分析，在132 ku處，誘導(dǎo)及純化后融合蛋白GST-NF-κB1均與NF-κB1抗體有免疫反應(yīng)特異性（見圖5），表明誘導(dǎo)、純化得到的融合蛋白即為GST-NF-κB1蛋白。

圖4　Western blotting及SDS-PAGE電泳鑒定純化的融合蛋白GST-NF-κB1Fig.4SDS-PAGE and Western blotting result of recombinant protein GST-NF-κB1 after purification

圖5　目的蛋白的Western blotting鑒定Fig.5Western blotting result of GST-NF-κB1 recombinant protein

3　討論

本研究成功構(gòu)建pGEX-4T-1-NF-κB1載體，利用IPTG對其大量誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲得目的蛋白。pGEX-4T-1載體是一種常用原核表達(dá)載體，其多克隆位點區(qū)域含有多個內(nèi)切酶位點序列，且全序列中含GST標(biāo)簽序列，是一種高效蛋白表達(dá)載體。誘導(dǎo)后的融合蛋白產(chǎn)物可通過GST層析柱快速、簡便純化，且在運載序列后含有蛋白酶切割位點，通過凝血酶X因子等切割后快速釋放該融合蛋白［12-13］。

本課題組前期確定處理該融合蛋白最佳IPTG作用濃度、時間及誘導(dǎo)溫度，分別為1 mmol·L-1、4 h、30℃。重組蛋白在宿主系統(tǒng)中高水平表達(dá)時，易形成包涵體。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的外源基因產(chǎn)物常以不可溶包涵體形式存在［14］。本試驗發(fā)現(xiàn)NF-κB1表達(dá)蛋白也主要存在于包涵體，包涵體的溶解和純化成為試驗難點［15-16］。Yang指出在一步法變性和復(fù)性過程中，6 mol·L-1鹽酸胍或8 mol· L-1尿素變性劑用于溶解存在于包涵體中的蛋白［17］。本試驗選用8 mol·L-1尿素溶解包涵體，足以用于后續(xù)試驗純化。由于大腸桿菌有些外膜蛋白在4～8 mol·L-1尿素中具有蛋白水解酶活性，包涵體溶解和復(fù)性過程會降解重組蛋白質(zhì)［18］，產(chǎn)生不同大小蛋白片段，導(dǎo)致一次過GST-Sepharose 4B柱純化后雜帶較多。但鑒于目標(biāo)蛋白含量較其他蛋白含量多，誘導(dǎo)蛋白適量稀釋經(jīng)二次純化過柱后，得到較純目的蛋白可直接進行后續(xù)試驗。

本研究獲得融合蛋白GST-NF-κB1，可為后期與其有關(guān)的其他上游蛋白質(zhì)同NF-κB1相互作用機制研究提供底物NF-κB1蛋白，并為NF-κB1及其家族其他成員結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究，探索NF-κB1在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程中新功能研究提供依據(jù)。

4　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-NF-κB1，利用最佳濃度的IPTG誘導(dǎo)獲得高水平表達(dá)重組蛋白。發(fā)現(xiàn)大量表達(dá)的蛋白多存在于包涵體中，在尿素進一步處理下，可獲得足量融合蛋白用于目的蛋白純化，經(jīng)過適量稀釋與二次GST過柱純化獲得NF-κB1蛋白。

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Prokaryotic expression and protein purification of gene bovineNF-κB1

GAO Xuejun，LI Shanshan，YU Mengmeng，LI Dong
（Key Laboratory of Agricultural Biological Functional Gene Laboratory of Heilongjiang Province，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

As an important nuclear transcription factor，NF-κB1 is involved in regulating the expression of lots of genes.Recent research found that NF-κB1 has important regulatory effect on milk synthesis by binding to many gens involved in the regulation of milk synthesis.BovineNF-κB1 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction（PCR）and was cloned intoEcoR I andXhoI sites of pGEX-4T-1 vector to construct the recombinant plasmid pGEX-4T-1-NF-κB1.The recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing.Then it was transformed intoEcoliBL21（DE3），induced by IPTG and purified the inclusion bodies was cracked with 8 mol·L-1urea，and GST-NFκB1 was purified by GST-Sepharose 4B beads，identified by SDS-PAGE and Western blotting analysis.Results showed that the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-NF-κB1 was successfully constructed.Western blotting and SDSPAGE confirmed the recombinant protein GST-NF-κB1 were expressed and purified.This study provided the experimental basis for the further research on the protein function of bovineNF-κB1.

bovine；NF-κB1；cloning；prokaryotic expression；purification

Q786

A

1005-9369（2016）09-0033-06

2016-06-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102504-03）

高學(xué)軍（1969-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為乳業(yè)生物技術(shù)。E-mail：gaoxj5390@sina.com