李　斌　林　源　辛亞龍　唐軍榮　尹麗莎　韓國偉　辛培堯

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；3. 大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003)

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無籽刺梨多倍體誘導(dǎo)試驗初報

李斌1,2林源3辛亞龍1唐軍榮1,2尹麗莎1,2韓國偉1,2辛培堯1,2

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；3. 大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003)

采用育種技術(shù)對無籽刺梨進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，以期獲得無籽刺梨多倍體植株。以秋水仙素作為誘導(dǎo)劑，二倍體組培苗為材料，比較不同的預(yù)培養(yǎng)時間、處理時間及秋水仙素濃度對無籽刺梨染色體加倍的誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明：無籽刺梨莖段在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1 d后，繼而用含300 mg/L秋水仙素溶液浸泡處理12 h，再進(jìn)行分化培養(yǎng)的誘導(dǎo)效果最佳，其誘導(dǎo)變異率達(dá)25.6%；無籽刺梨多倍性植株同質(zhì)化培養(yǎng)的最佳次數(shù)為6次。對變異植株根尖細(xì)胞進(jìn)行染色體計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，部分變異植株的根尖細(xì)胞染色體為2n=4x=28，為四倍體。部分植株同時存在2n=2x=14和2n=4x=28兩種倍性細(xì)胞，為嵌合體。

無籽刺梨；多倍體誘導(dǎo)；浸泡處理；染色體數(shù)；組織培養(yǎng)

無籽刺梨 (Rosasterilis) 是薔薇科 (Rosaceae) 薔薇屬 (Rosa) 的多年生攀援小灌木，為中國特有種，是刺梨 (R.roxbunghii) 的近緣種[1]。其野生資源主要分布在貴州安順市北部和貴陽市南部，近年來多地大量進(jìn)行引種種植[2]。無籽刺梨具有較高的藥用保健、觀光、生態(tài)保護(hù)和經(jīng)濟(jì)價值。與普通刺梨相比，無籽刺梨無籽或有1～2粒籽，單寧含量較少，糖含量更高，肉厚且果味香甜，無明顯澀味，鮮果售賣更有優(yōu)勢。其無籽的特性，可以減少加工成本[3]。但是，無籽刺梨果實營養(yǎng)成分VC、VE和SOD含量比刺梨少[4-5]，果徑比刺梨小，可食用部分也較少[6]，在一定程度上極大影響了這一特色植物的生產(chǎn)利用價值。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)選育果實大，營養(yǎng)成分含量高的無籽刺梨，成為其產(chǎn)業(yè)開發(fā)，提高無籽刺梨經(jīng)濟(jì)價值的當(dāng)務(wù)之急。而在諸多的植物育種手段中，倍性育種所選育的多倍體品種能顯著增加果實體積及營養(yǎng)成分含量[7]。因此，對無籽刺梨進(jìn)行多倍體育種，選育較高倍性的無籽刺梨，無疑是解決上述問題的有效方法之一。無籽刺梨品種改良，僅見韋景楓等[8]對其進(jìn)行了單株選優(yōu)方面的研究，而在倍性育種方面未見報道。本研究以無籽刺梨幼嫩莖段為材料，利用先浸泡處理，再離體培養(yǎng)的方法[9]，進(jìn)行無籽刺梨多倍體的誘導(dǎo)，并對變異材料的倍性進(jìn)行鑒定和分析。研究結(jié)果可為無籽刺梨多倍體育種提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料選用西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保育重點實驗室所建立的無籽刺梨無菌苗。

1.2試驗方法

1.2.1材料的誘導(dǎo)處理

將無菌苗莖段去除葉片和頂端后，截成長1 cm左右，每段至少保留1個葉腋，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA中預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時間分別為0、1、2、3 d，預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行光照培養(yǎng)。光培養(yǎng)期間，先將預(yù)培養(yǎng)后的莖段分別浸泡于含不同濃度 (200、300、400、500 mg/L) 秋水仙素的無菌水中，并置于搖床上以120 r/min，25～30 ℃避光震蕩，處理時間分別為12、24、48、72 h。對照組的莖段置于無菌水中避光震蕩培養(yǎng)處理12、24、48、72 h，方法同上。處理后，將莖段放在超凈工作臺上，用無菌過濾紙吸盡表面殘留液體，再轉(zhuǎn)入MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA (未附加秋水仙素) 的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。試驗不考慮交互作用，采用L16(43) 正交設(shè)計進(jìn)行試驗，試驗處理共計16組，每組接種10瓶，每瓶接種莖段5枚，重復(fù)3次。

1.2.2變異芽的同質(zhì)化處理

經(jīng)誘導(dǎo)后，具有多倍性的材料大多為 “嵌合體”， 因此需要對這一類材料進(jìn)行 “同質(zhì)化”，以期得到倍性一致、性狀穩(wěn)定的多倍體材料。采用陳杰等[10]提出的方法，挑取生長狀況良好、變異明顯的材料 (表現(xiàn)為葉片變大變厚，莖段變粗變短) 進(jìn)行分化培養(yǎng)，剪成0.5～1 cm莖段，平鋪于培養(yǎng)基MS + 0.5 mg/L 6-BA + 0.15 mg/L NAA中培養(yǎng)。經(jīng)過40 d左右的培養(yǎng)，待重新分化出的叢生芽，長勢比較一致且能夠很好的觀察叢生芽性狀時，定義為完成1個同質(zhì)化周期的培養(yǎng)，記為第1次同質(zhì)化處理，然后繼續(xù)挑選性狀良好、多倍性狀突出的叢生芽，重復(fù)上述培養(yǎng)過程8次，觀察培養(yǎng)不同次數(shù)后的分化芽數(shù)、死亡芽數(shù)及多倍化芽數(shù)比率。

1.2.3變異材料的倍性鑒定

當(dāng)同質(zhì)化處理的芽長至2～3 cm時，與對照組比較，將變異明顯的無籽刺梨芽苗轉(zhuǎn)入1/2MS + 0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA + 0.3 g/L活性炭的培養(yǎng)基中生根。并采用林源等[11]提出的方法，對變異的無籽刺梨組培苗及二倍體材料根尖染色體數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，以確定其倍性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理對無籽刺梨多倍體誘導(dǎo)的影響

不同處理條件下無籽刺梨誘導(dǎo)率的方差分析結(jié)果表明，各處理誘導(dǎo)率之間存在顯著差異，見表1。

由表1可知，未進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的處理中誘導(dǎo)率最低，處理1、4誘導(dǎo)率為0。在相同的預(yù)處理時間和相同濃度處理下，隨著秋水仙素處理時間的增加，誘導(dǎo)率有下降趨勢；在預(yù)處理和秋水仙素處理的時間相同時，隨著秋水仙素處理濃度的增加，誘導(dǎo)率有上升趨勢，但當(dāng)濃度達(dá)到500 mg/L時，誘導(dǎo)率明顯降低，最佳的秋水仙素誘導(dǎo)處理濃度為300～400 mg/L。多重比較結(jié)果表明，處理6、11、14無籽刺梨多倍體芽的平均誘導(dǎo)率較高，且三者之間無顯著差異。其中，處理6、14與處理11相比，秋水仙素用量較少，而處理6中，秋水仙素處理時間較短。因此認(rèn)為，預(yù)培養(yǎng)1 d后，用300 mg/L秋水仙素處理12 h，為誘導(dǎo)無籽刺梨多倍體產(chǎn)生的較佳處理方案，其誘導(dǎo)率為25.6%。

表1　不同處理對無籽刺梨多倍體誘導(dǎo)的影響

注：同列中不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.2多倍體叢生芽同質(zhì)化培養(yǎng)

在嵌合體同質(zhì)化培養(yǎng)過程中，隨著分化培養(yǎng)次數(shù)的增加，分化芽數(shù)、死亡芽數(shù)、多倍體芽數(shù)比率等均出現(xiàn)了不同的變化情況，見圖1。

由圖1可以看出，隨著同質(zhì)化培養(yǎng)次數(shù)的增加，多倍化材料比率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，從第1次分化到第5次分化，多倍化材料比率從26%上升到30%，上升趨勢平緩。第5次分化以后，多倍化材料比率上升速度明顯高于前5次，當(dāng)分化到第8次時，多倍化材料比率達(dá)到了46%；其后隨著分化次數(shù)的增加，分化芽數(shù)出現(xiàn)下降趨勢；隨著誘導(dǎo)分化次數(shù)增加，死亡率從0上升到了15%，在重復(fù)分化6次以后死亡比率上升速度明顯。因此，無籽刺梨多倍化植株同質(zhì)化培養(yǎng)的最佳次數(shù)為6次。

圖1不同同質(zhì)化次數(shù)對多倍體誘導(dǎo)效果的影響

Fig.1Influence on polyploid induction effect in different homogenization frequency

2.3鑒定結(jié)果

經(jīng)多次同質(zhì)化處理后，對無籽刺梨生根組培苗的根尖細(xì)胞染色體數(shù)目進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，無籽刺梨二倍體染色體數(shù)目是2n=2x=14 (圖2a)。變異植株中，部分材料根尖細(xì)胞染色體數(shù)目均為28條，可判定為四倍體 (圖2b)；而部分材料中，既有14條染色體細(xì)胞，又有28條染色體細(xì)胞，可斷定為嵌合體。試驗中未發(fā)現(xiàn)有三倍體細(xì)胞的產(chǎn)生。

圖2　二倍體與四倍體染色體數(shù)目差異

3　結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：無籽刺梨莖段在分化培養(yǎng)基上預(yù)養(yǎng)1 d后，用含300 mg/L秋水仙素處理12 h的誘導(dǎo)效果最佳，其誘導(dǎo)變異率達(dá)25.6%；無籽刺梨多倍性植株同質(zhì)化培養(yǎng)的最佳次數(shù)為6次。對變異植株根尖細(xì)胞進(jìn)行染色體計數(shù)后發(fā)現(xiàn)，根尖細(xì)胞染色體為2n=4x=28，為四倍體。部分植株中同時存在2n=2x=14和2n=4x=28兩種倍性細(xì)胞，為嵌合體。

秋水仙素是多倍體誘導(dǎo)中常用的誘變劑，其濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)方法是影響多倍體誘導(dǎo)效率的主要因素。由于外植體來源不同，其對秋水仙素的耐受性和敏感性不同[12]，因此，須選擇不同的秋水仙素濃度、處理時間和處理方法。一般來說，選用的濃度越高，處理時間應(yīng)較短；濃度越低，處理時間應(yīng)該相應(yīng)延長。常用離體條件下誘導(dǎo)植物多倍體的方法有浸漬法和混培法，解謎[13]采用混培法在0.002%秋水仙堿中長時間處理，誘導(dǎo)山葡萄 (Vitisamurensis) 多倍體效果最佳，而用浸泡法在0.2%秋水仙素溶液中浸泡處理6 h誘變率最高。李曉燕[14]認(rèn)為當(dāng)處理濃度和時間合適，浸泡法比混培法的誘導(dǎo)效果好。本試驗在預(yù)試驗中也得出浸泡法的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于混培法，故采用浸泡法對無籽刺梨進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)。但也有學(xué)者認(rèn)為，混培法誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生要優(yōu)于浸泡法[9,15-16]。因此，選擇哪一種誘變方法應(yīng)建立在多次試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合植物本身的生物特性來決定。

在不同處理組合下，處理6、11與處理14的誘導(dǎo)效果無顯著差異，但處理6和14中秋水仙素的用量均小于處理11，而處理6所需時間小于處理11。一般認(rèn)為，較高濃度秋水仙素處理較長時間，并不利于被誘導(dǎo)材料后期化學(xué)毒害的解除與生長恢復(fù)。因此，在誘導(dǎo)結(jié)果無明顯差異的情況下，選擇處理6，即先預(yù)培養(yǎng)1 d，再在300 mg/L的秋水仙素溶液中處理12 h，作為誘導(dǎo)無籽刺多倍體產(chǎn)生的較佳處理方案。

嵌合體問題是關(guān)乎于能否獲得性狀穩(wěn)定的多倍體的關(guān)鍵，也是多倍體誘導(dǎo)的難題。在誘變苗形成初期 (15～30 d)，變異形態(tài)明顯，隨著幼苗成長，部分變異植株的外部形態(tài)與正常二倍體逐漸相似，最終恢復(fù)為二倍體植株。由于變異的多倍體細(xì)胞，在生長初期，其生活力較弱，比正常二倍體細(xì)胞分裂速度慢，倍性嵌合的植株隨著生長發(fā)育，變異的嵌合體組織會逐漸發(fā)生層間取代，最終表現(xiàn)出性狀恢復(fù)，而使得多倍體誘導(dǎo)失敗[7]。試驗發(fā)現(xiàn)，采用培養(yǎng)基中添加秋水仙素的誘導(dǎo)方法，材料基部形成的愈傷組織致密，呈淡黃色，且部分失去再分化能力，分化能力明顯減弱。可見，秋水仙素對愈傷組織的再分化能力有明顯抑制或毒害作用。然而，將經(jīng)過秋水仙素處理的單株苗轉(zhuǎn)至未附加秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，大部分表現(xiàn)出生長狀態(tài)和增殖能力明顯優(yōu)于對照的現(xiàn)象，表現(xiàn)為多倍化材料相對于二倍體材料具有生長方面的優(yōu)勢。

隨著研究的深入, 試驗中出現(xiàn)了一些有待徹底解決的問題。1) 需要找到一種更適宜的誘導(dǎo)劑, 因為秋水仙素屬于生化制品, 價格昂貴且對生物體有毒, 與組織培養(yǎng)結(jié)合時, 不僅使離體組織受害、抑制不定芽的分化, 而且再生植株生長緩慢, 甚至可能使外植體在繼代培養(yǎng)基中褐化死亡；2) 嵌合體現(xiàn)象還不能完全克服, 真正同一倍性的多倍體出現(xiàn)的有效頻率不高。鑒于以上存在的問題, 在后期的研究中需找到一種安全高效的誘導(dǎo)劑, 既能保證較高的成活率又能保證較高的誘變率。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，二硝基苯胺類除草劑與秋水仙堿誘導(dǎo)多倍體的機(jī)理一致，并且與植物微管蛋白有著更高的親和力，在相當(dāng)濃度下比秋水仙堿誘導(dǎo)效果更佳，且其毒性較小。因此，可作為秋水仙堿的代替品[18]。另外，要進(jìn)一步研究嵌合體分離的時機(jī)和分離技術(shù)，提高多倍體同質(zhì)化效率，得到更多的染色體數(shù)目一致的多倍體種質(zhì)。

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(責(zé)任編輯韓明躍)

Preliminary Report on PolyPloidy Induction ofRosasterilis

Li Bin1,2, Lin Yuan3, Xin Yalong1, Tang Junrong1,2, Yin Lisha1,2, Han Guowei1,2, Xin Peiyao1,2

(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224,China; 2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest Region of State Forestry Administration, Kunming Yunnan 650224,China; 3. Dali Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Dali Yunnan 671003,China)

The polyploidy breeding technology was used to induceRosasterilispolyploidy, for the obtaining ofR.sterilispolyploidy plants. The colchicine was used as induction dose, diploid cuvette seedling ofR.sterilisas material, to compare induction effect on chromosome doubling in different preculture time, different colchicine concentration and different treatment time. The results showed that after preculture in differentiation medium for 1 d, and soaking in 300 mg/L colchicine solution for 12 h, then differentiation culture in differentiation medium, the induction effect was better, and the mutation rate was 25.6%. The best culture frequency of homogenization was 6. After observing the chromosome number in root-tip of mutation plants, it was found that chromosome number in some tetraploid plants cells was 2n=4x=28,while cells with both 2n=2x=14 and 2n=4x=28 in some chimera plants.

Rosasterilis, polyploid induction, soaking treatment, choromosome number, tissue culture

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 05. 005

2016-04-15

云南省林學(xué)一級學(xué)科博士點建設(shè)項目；西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室開放基金項目；云南省省院省校教育合作咨詢共建重點學(xué)科項目 (211015) 資助。

辛培堯 (1975—)，男，博士，副教授。研究方向：林木遺傳育種與繁育。Email: xpytgyx@163.com。

S718.46

A

2095-1914(2016)05-0027-05

第1作者：李斌 (1988—)，男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種與繁育。Email: 445118715@qq.com。