許麗娟，陳 薇，吳迎奔，王 震，汪 彬，賀月林

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

亞硝酸鹽降解菌N419的培養(yǎng)基優(yōu)化

許麗娟，陳 薇，吳迎奔，王 震，汪 彬，賀月林

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

為了規(guī)?；a(chǎn)和實際應(yīng)用亞硝酸鹽降解菌N-419，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，選出由單因素試驗確定的營養(yǎng)物質(zhì)（玉米淀粉、工業(yè)蛋白胨）以及CaCl2和MnSO4，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗。結(jié)果表明：N-419菌株的最佳培養(yǎng)基配方為玉米淀粉20 g/L、工業(yè)蛋白胨10 g/L、CaCl 0.3 g/L、MnSO 0.2 g/L、KHPO 0.12 g/L、KHPO 0.25 g/L，其芽孢數(shù)可達(dá)1.44×1010CFU/m L。

亞硝酸鹽降解菌；枯草芽孢桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化

隨著我國規(guī)?；?、高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，魚食料及肥料投放量日益增加，養(yǎng)殖水體中各類有機(jī)污物隨之增加，進(jìn)而引起水體富營養(yǎng)化，造成水體中氮素過剩，亞硝酸鹽含量超標(biāo)，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞［1-3］。據(jù)報道，養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽含量過高可削弱養(yǎng)殖動物的抗病能力，影響?zhàn)B殖動物的生長，甚至可使養(yǎng)殖動物死亡［4］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。因此，如何有效地降低養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的含量，凈化水環(huán)境成為人們關(guān)注的焦點問題。

為了減輕亞硝酸鹽污染帶來的危害，在養(yǎng)殖過程中常采用曝氣、增氧、投加微生物制劑等方法進(jìn)行預(yù)防。其中，投加微生物制劑法具有效果明顯、價格低廉的優(yōu)點，且無毒副作用、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性，深受廣大用戶的青睞［5-6］。

芽孢桿菌（Bacillus）能促進(jìn)水生動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)其消化機(jī)能，同時還能減少水體中的亞硝酸鹽和H2S等有害物質(zhì)，促進(jìn)水環(huán)境生態(tài)良性循環(huán)，已在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用［7］。研究以前期篩選純化的高效降亞硝酸鹽的枯草芽孢桿菌N-419為材料，通過單因素試驗和正交試驗初步優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，旨在為該菌的規(guī)模化生產(chǎn)和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種 枯草芽孢桿菌N419，由湖南省微生物研究院環(huán)保微生物室自行分離和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子及斜面保存培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0于0.1 MPa滅菌20 m in。在此培養(yǎng)基中添加2.0%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。培養(yǎng)基優(yōu)化時按試驗設(shè)計方案調(diào)整各組成成分。

1.1.3 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)條件：從斜面挑取一接種環(huán)菌苔于100 m L種子培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)10 h。發(fā)酵培養(yǎng)條件：在500 mL三角瓶中裝入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 m L，接種量3%，于37℃，180 r/m in恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.1 碳、氮源試驗 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用10 g/L葡萄糖、淀粉、蔗糖和玉米淀粉作唯一碳源，其他組分不變，制成培養(yǎng)基。通過檢測各處理活菌數(shù)和芽孢數(shù)，以確定最佳碳源。確定碳源以后，分別以10 g/L牛肉膏、尿素、酵母膏、工業(yè)蛋白胨為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，確定培養(yǎng)基中的最佳氮源。

1.2.2 正交試驗 通過單因素實驗，以芽孢桿菌芽孢數(shù)為指標(biāo)，選擇酵母膏和玉米淀粉作為氮源和碳源，CaCl2和MnSO4為無機(jī)鹽，每個因素分別選擇3個水平，設(shè)計正交試驗（表1），用L9（34）正交表對各組分進(jìn)行優(yōu)化試驗。每組實驗設(shè)3個平行，500 mL三角瓶裝液量100 m L，最佳發(fā)酵條件，培養(yǎng)24小時測定芽孢數(shù)。

表1 芽孢桿菌N419發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗設(shè)計（g/L）

1.3 細(xì)菌總數(shù)和芽孢總數(shù)的測定

采用結(jié)晶紫染色法確定發(fā)酵液的芽孢產(chǎn)率，用血球計數(shù)板測得細(xì)菌濃度，由此計算可得芽孢數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳 源

從圖1中可以看出，不同碳源對枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌數(shù)和芽孢數(shù)有不同的影響。其中，以玉米淀粉作碳源時枯草芽孢桿菌菌體數(shù)和芽孢數(shù)最高，分別為8.2×109和6.9×109CFU/mL，因此選擇玉米淀粉作為枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基碳源成分。

圖1 不同碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響

2.2 氮 源

由圖2可知，枯草芽孢桿菌在含有牛肉膏、酵母膏、工業(yè)蛋白胨的培養(yǎng)基中活菌數(shù)、芽孢數(shù)不存在顯著差異，尿素作為氮源時的菌體數(shù)和芽孢數(shù)遠(yuǎn)低于其他氮源。由于工業(yè)蛋白胨容易獲得，原料價格低廉，因此選用工業(yè)蛋白胨作為氮源使用。

2.3 正交試驗結(jié)果

圖2 不同氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響

由表2的極差分析可看出，影響菌株N-419發(fā)酵水平的主次因素關(guān)系為：玉米淀粉＞工業(yè)蛋白胨＞MnSO4＞CaCl2，因素間最佳水平組合為A2B2C1D3。結(jié)合無機(jī)鹽的篩選結(jié)果，添加其他兩種可以提高發(fā)酵水平的無機(jī)鹽，枯草芽孢桿菌N-419的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉20 g/L，工業(yè)蛋白胨10 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，K2HPO40.12 g/L，KH2PO40.25 g/L。在此條件下，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)1.44× 1010CFU/mL。從表3可以看出，F(xiàn)玉米淀粉=60.499＞F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)工業(yè)蛋白胨=43.128＞F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)MnSO4=33.977＞F0.05（2，2）=19.00，說明玉米淀粉、工業(yè)蛋白胨和MnSO4的作用均達(dá)到顯著水平，這3種因素在發(fā)酵過程中對枯草芽孢桿菌N-419的生長起著關(guān)鍵作用。

表2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基濃度的正交試驗結(jié)果

表3 枯草芽孢桿菌正交試驗方差分析

3 結(jié)論與討論

亞硝酸鹽是氮素循環(huán)過程細(xì)菌硝化與反硝化過程中重要的中間產(chǎn)物。水體中的亞硝酸鹽是魚、蝦養(yǎng)殖研究通過單因素和正交試驗初步優(yōu)化了枯草芽孢桿菌N-419的發(fā)酵培養(yǎng)基，為規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。綜合考慮其投入產(chǎn)出比，適合工業(yè)化發(fā)酵與否，優(yōu)選來源容易、價格低廉、菌數(shù)和芽孢數(shù)高的玉米淀粉作為培養(yǎng)基的碳源成分，工業(yè)蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源成分。對發(fā)酵培養(yǎng)基組分含量進(jìn)行正交試驗，枯草芽孢桿菌N-419的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉20 g/L，工業(yè)蛋白胨10 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，K2HPO40.12 g/L，KH2PO40.25 g/L。在此條件下，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵芽孢數(shù)可達(dá)1.44×1010CFU/mL。

過程中的重要危害因素之一［8］。當(dāng)水體中亞硝酸鹽濃度累積到0.1 mg/L后，亞硝酸鹽可通過水產(chǎn)動物的鰓和體表進(jìn)入其血液，與血液中的攜氧蛋白結(jié)合，使血液失去攜氧功能，從而水產(chǎn)動物出現(xiàn)食量下降、呼吁困難、鰓部受損等癥狀。若長時間生活在亞硝酸鹽濃度較高的環(huán)境下，水產(chǎn)動物的活力變差，自身免疫力也下降，易爆發(fā)各種疾?。?］。而微生態(tài)制劑可有效分解、合成或轉(zhuǎn)化水體中的有害物質(zhì)，從而凈化水質(zhì)，調(diào)節(jié)水體環(huán)境［10］。據(jù)報道，枯草芽孢桿菌能有效調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境，凈化水質(zhì)，減少換水次數(shù)，大大節(jié)約養(yǎng)殖成本。同時，該菌還可減少抗生素的使用，提高水產(chǎn)品品質(zhì)［11］。

［1］ 劉德生，史彩華，李志新. 降解養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽的研究進(jìn)展和前景分析［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（4）：14-15.

［2］ 徐霞旭，周永燦，鄭 興，等. 一株高效水質(zhì)改良菌的篩選鑒定及其作用效果研究［J］. 水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（4）：231-236.

［3］ 田 彬. 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的危害及控制［J］. 漁業(yè)致富指南，2008，（15）：57.

［4］ 周冬仁，沈錦玉，潘曉藝，等. 一株亞硝酸鹽降解菌的分離鑒定［J］.農(nóng)學(xué)學(xué)報，2011，（2）：49-53.

［5］ 王會聰，曹海鵬，何 珊，等. 一株亞硝酸鹽降解菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析［J］. 環(huán)境污染與防治，2012，34（4）：32-36.

［6］ 王 艷. 芽孢桿菌在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的作用［J］. 呼倫貝爾學(xué)院學(xué)報，2015，23（2）：109-116.

［7］ 洪徐鵬，段燕君，周佳楠，等. 微生態(tài)制劑在改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫力中的應(yīng)用［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（22）：7431-7434.

［8］ 宋 蓉，許春蘋，梁運祥. 一株干酪乳桿菌對養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽去除機(jī)理的研究［J］. 淡水漁業(yè)，2013，43（1）：3-8.

［9］ 宋余鳳，楊寶圣. 亞硝酸鹽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的危害及解決方法［J］. 科學(xué)養(yǎng)魚，2010，（7）：16.

［10］ 袁科平，鄒世平，李 谷，等. 一株水產(chǎn)地衣芽孢桿菌的鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，40（1）：69-73.

［11］ 尹文林，沈錦玉，沈智華，等. 枯草芽孢桿菌B115株對水質(zhì)改良效果研究［J］. 漁業(yè)現(xiàn)代化，2006，（6）：9-11，20.

（責(zé)任編輯：成 平）

Optim ization of Culture Media for A Bacillus Subtilis of Degrading Nitrite

XU Li-juan，CHEN Wei，WU Ying-ben，WANG Zhen，WANG Bin，HE Yue-lin
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to use nitrite degrading bacteria N-419 in scale production， ed its culture medium was optim ized. According to the results of single factor orthogonal test for culture optimization， the orthogonal experiment with 4 factors （corn powder， industrial peptone, CaCl2， MnSO4） and 3 levels was carried out. The results showed that optimal medium was as follows： corn powder 20 g/L， industrial peptone 10 g/L， CaCl20.3 g/L， M nSO4 0.2 g/L， K2HPO40.12 g/L， KH2PO40.25 g/L， respectively. Under the conditions， 1.44×1010CFU bacteria per m illiliter were obtained.

nitrite； Bacillus subtilis； medium optimization

Q939.96

A

1006-060X（2016）09-0010-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.004

2016-07-05

湖南省科技計劃（2015CK3008）

許麗娟（1980-），女，湖南岳陽市人，高級農(nóng)藝師，主要從事環(huán)境微生物研究。

賀月林

242424