蘇暢，李枝林，任智慧，王玉英

(云南農業(yè)大學 園林園藝學院花卉研究所，云南　昆明650201)

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輻射誘發(fā)葉藝蘭形態(tài)特征和生理特性差異的研究*

蘇暢，李枝林，任智慧，王玉英

(云南農業(yè)大學 園林園藝學院花卉研究所，云南昆明650201)

為闡明輻射誘發(fā)蘭花變異體的產生，以黃色素花虎頭蘭與黃蟬蘭F1代雜交組培苗經(jīng)60Coγ射線輻射誘變，且經(jīng)6次繼代培養(yǎng)性狀穩(wěn)定的優(yōu)良變異株系(葉藝蘭株TRIR-2、TRIR-3)和原雜交苗F1代TRIR-1(葉片全綠)為試材，通過組織培養(yǎng)方式研究這3種蘭株在形態(tài)和生理特性方面的差異。結果顯示：與原雜交苗F1 TRIR-1相比，(1)隨著葉藝藝象程度增加，植株矮化越明顯，藝象最明顯植株的生物量、株高、葉長、葉寬和根長都下降，但根數(shù)不減，葉片數(shù)增多;(2)葉藝植株增強了光合產物可溶性糖的合成，而葉片全綠植物有利于促進蛋白質的合成；(3)植株葉藝藝象越明顯，葉綠素含量越低，對光能的利用和調節(jié)能力較低，同時植株的膜脂過氧化傷害增強，但葉藝植株能通過調節(jié)抗氧化物酶活性來應對。研究表明，輻射誘發(fā)了蘭花葉藝型突變體新品系，可從中選育出葉藝蘭新品種。

輻射；葉藝蘭；形態(tài)特征；生理特性；60Coγ射線；誘變

蘭花是中國的傳統(tǒng)名貴花卉，其婀娜多姿的葉片具有很高的觀賞價值。葉藝蘭(線藝蘭)是指蘭屬(Cymbidium)植株的葉片上鑲嵌著金黃色或銀白色或濃綠色或朱紅色或墨黑的嘴、邊、點、線、斑的中國蘭統(tǒng)稱[1]。葉(線)藝蘭品種以墨蘭(C.sinense)最多，建蘭(C.ensifolium)次之，春蘭(C.goeringii)、蕙蘭(C.faberi)與寒蘭(C.kanran)較少，其栽培歷史已有千年之久，被譽為“花中君子”，是珍貴的觀賞花卉[2]。葉(線)藝最早流行于日本，培育出了‘加冶屋’、‘真鶴’、‘瑞玉’等許多葉(線)藝蘭品種。在中國大陸流行則是近幾十年的事，雖然起步較遲，但發(fā)展迅猛，奇花、奇葉和矮種等各種變異類型層出不窮，市場前景十分廣闊。葉藝蘭由于葉片艷麗，形態(tài)優(yōu)美，在國內外有極高聲譽，被譽為珍貴名花，很受市場歡迎。

只有蘭花遺傳基因產生變異才能出現(xiàn)真正的葉(線)藝蘭，為可遺傳的變異，藝性才能夠世代穩(wěn)定遺傳[3]。

輻射誘變育種是一種常用的育種手段，可以創(chuàng)造更多的葉藝類型，目前已在月季、菊花、美人蕉、大麗花、葉子花、荷花[4]，以及多種蘭屬植物[5～7]上應用，并獲得了多種突變體，主要特征表現(xiàn)為植株失綠。近年來，國內許多科學家用缺乏葉綠素的突變體為材料，對其遺傳性、突變體與野生型材料在光合色素的組成、葉綠體結構、功能、蛋白質組分等方面的差異進行了一系列的研究[8～10]。但對蘭屬植物輻射誘發(fā)葉藝蘭形態(tài)特征與生理特性差異研究未見報道。因此本文以課題組經(jīng)輻射誘發(fā)的葉藝蘭突變體與野生型為試材，通過測定分析植株的形態(tài)特征與生理特性方面的差異，為闡明輻射誘發(fā)了蘭花葉藝型變異體的產生奠定理論依據(jù)，對指導蘭屬其他種和變種的人工葉藝新品系的育成具有重要的參考價值。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試材料為TRIR-1、TRIR-2和TRIR-3的組培苗(圖1)。將黃色素花虎頭蘭(C.tracyanum)與黃蟬蘭(C.iridioides)雜交，獲得F1雜交苗，之后通過外觀形態(tài)篩選出性狀穩(wěn)定、一致的F1代株系(TRIR-1)，在云南華源輻射有限公司進行60Coγ射線劑量23.6Gy,劑量率為1 Gy/min，急性照射后，培育2年，發(fā)現(xiàn)數(shù)株葉藝株系，再經(jīng)過6年的組培培養(yǎng)，繼代10次后，獲得2個性狀穩(wěn)定的葉藝蘭新品系。一個品系為葉片上的綠色與白色相間，面積基本對等，命名為TRIR-2；另一個品系為葉尖和葉邊緣為綠色，葉片其他部位是白色，其葉藝部分觀賞價值較高、葉形較為優(yōu)美，命名為TRIR-3。

圖1野生型和輻射誘變的葉藝蘭植株

Fig.1Plants of wild type and irradiationCymbidiumwith verge line pattern leaves

1.2材料處理

試驗于2013年5月在云南農業(yè)大學花卉研究所實驗室內進行。在相同的培養(yǎng)時間和培養(yǎng)環(huán)境的條件下，在1/2 MS+NAA 1.0mg/L+ 0.1%活性碳的固體培養(yǎng)基中，分別選擇植株大小大致相等，葉片數(shù)和植株高度、葉色相當?shù)腡RIR-1、TRIR-2和TRIR-3組培苗。每組苗設置3個重復，并對植株進行編號。取由基部向上數(shù)的第3～5片葉2g，液氮速凍保存于置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于測定葉綠素、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、可溶性糖含量及超氧化物歧化酶活性(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性。

1.3測定指標及方法

1.3.1 形態(tài)指標測定

用上述選擇處理植株的方法，選出另外9個植株。用直尺和天平分別測定單株植株的株高、葉片數(shù)、葉長、根長、根數(shù)和鮮重。

1.3.2生理指標

葉綠素含量測定采用分光光度計比色法[11]；超氧化物歧化酶活性(SOD)采用氮藍四唑(NBT)法[12]，抗壞血酸過氧化物酶(APX)采用陳建勛等的方法進行[12]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]、過氧化氫酶(CAT)活性采用Acbi等的方法進行測定[14]。丙二醛含量參照Madhava等[15]的硫代巴比妥酸(TBA)法測定；可溶性蛋白質含量參照Read等[16]考馬斯亮藍法測定；可溶性糖含量參照采用趙可夫[17]蒽酮比色法測定。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用大型統(tǒng)計軟件SPSS(Inc.，Chicago,IL，USA)的方差分析(ANOVA)和Duncan的多重比較法進行分析，用Excel 2003制圖。

2　結果與分析

2.1輻射誘變的葉藝蘭植株形態(tài)特征差異

由表1可知，TRIR-1、TRIR-2和TRIR-3植株在株高、葉長、葉寬、根長和鮮重方面存在差異。TRIR-1植株的株高分別顯著高于TRIR-2和TRIR-3植株21.2%和177.7%(P<0.05)。TRIR-1植株的葉長、葉寬、根長和鮮重分別顯著高于TRIR-3植株的161.5%、112.2%、74.90%和193.1%(P<0.05)；同時TRIR-1植株的葉長、葉寬、根長和鮮重與TRIR-2植株差異不顯著(P>0.05)。TRIR-3植株的葉片數(shù)顯著高于TRIR-1植株33.3%(P<0.05)；TRIR-1 、TRIR-2和TRIR-3植株的根數(shù)無差異顯著性(P>0.05)。以上結果表明隨著葉藝藝象程度的增加，植株矮化越明顯，藝象最明顯植株的鮮重、株高、葉長、葉寬和根長都下降，但根數(shù)不減，葉片數(shù)增多，這可能是葉藝藝象程度最高的植株能生長發(fā)育的重要原因之一。

表1　輻射誘變的葉藝蘭形態(tài)特征

注：同列不同字母表示處理間在0.05水平存在顯著性差異；下同。

2.2輻射誘變的葉藝蘭植株葉綠素含量差異

由表2可知，全綠植株TRIR-1的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量分別顯著高于TRIR-2和TRIR-3植株100%和125.3%、77.8%和144%、93.2%和129.6%(P<0.05)；葉藝植株TRIR-3的葉綠素a/b顯著高于TRIR-1和TRIR-2植株12.6%和26.7%(P<0.05)，TRIR-1和TRIR-2植株的葉綠素a/b差異不顯著(P>0.05)。以上結果說明植株藝象越明顯，葉綠素含量越低，這與葉藝植株表觀呈現(xiàn)的綠色一致。

表2　輻射誘變的葉藝蘭植株葉綠素含量差異

2.3輻射誘變的葉藝蘭植株可溶性糖和蛋白含量差異

由圖2A可知,TRIR-2植株的可溶性糖含量分別顯著高于TRIR-1和TRIR-3植株74.0%和61.3%(P<0.05)，TRIR-1和TRIR-3的植株可溶性糖含量差異不顯著(P>0.05)；由圖2B可知，TRIR-1植株的可溶性蛋白質含量均顯著高于TRIR-2和TRIR-3植株的53.9%和191.2%(P<0.05)，TRIR-2植株的可溶性蛋白質含量顯著高于TRIR-3植株的89.3%(P<0.05)。說明全綠植物在光合作用中，更利于促進蛋白質的合成；葉片上的綠色與白色相間，面積基本對等的植株有利于可溶性糖的合成；葉片葉藝藝象程度最高的植株TRIR-3合成的光合產物量較低。

圖2輻射誘變的葉藝蘭可溶性糖(A)和蛋白含量(B)

Fig.2Total soluble protein (A) and sugar content (B) of irradiationCymbidiumwith verge line pattern leaves

2.4輻射誘變葉藝蘭MDA和H2O2含量及抗氧化物酶活性差異

由圖3可知，TRIR-1、TRIR-2和TRIR-3植株的MDA和H2O2含量及抗氧化物酶活呈現(xiàn)一致上升的趨勢。TRIR-3植株的MDA和H2O2含量，以及SOD、POD、CAT和APX酶活分別顯著高于TRIR-1和TRIR-2植株51.5%和33.0%、35.8%和17.7%、18.8%和7.9%、31.5%和9.1%、22.8%和9.1%及60.0%和8.7%(P<0.05)。表明隨著葉藝藝象程度增強，植株的膜脂過氧化傷害增加，但植株能通過調節(jié)增強抗氧化物酶活性來應對。

3　討論

變異是生物進化的基礎推動力，人為地利用這種方式，用盡可能小的影響基礎生命代謝的方式最大限度地追求對物種變異的加速，正是誘導變異的研究目的[15～16]，輻射誘變是常用的人為誘導變異手段。陳華等[18]報道的國蘭輻射誘變產生出葉片短小型、線藝葉等不同的變異類型和張志勝等[19]用秋水仙素處理墨蘭和大花蕙蘭(C.hyridus)的雜交F1種子誘導的原球莖,發(fā)現(xiàn)變異植株的類型包括植株粗壯、多葉、植株矮化、線藝和葉藝等一致。本文的供試材料是經(jīng)輻射誘變后再經(jīng)過6年的組培繼代培養(yǎng)，特異性狀穩(wěn)定的葉藝新品系，葉藝蘭株同樣出現(xiàn)了鮮重、株高、葉長、葉寬和根長降低，植株矮化等現(xiàn)象；同時葉藝藝象程度越高的植株，葉片數(shù)顯著增加的現(xiàn)象。

光合作用是在葉綠體內進行的，葉綠素對光合作用過程是必不可少的。植物葉片呈現(xiàn)出的綠色是由含于植物葉細胞中的葉綠素產生的[20]，而葉綠素在綠色植物中主要包含葉綠素a和b[21]。植物體內的葉綠素在不斷地合成和分解中，而在不利條件下，葉綠素的分解速度會大大超過合成的速率，從而使光合作用受到抑制，葉片出現(xiàn)各種傷斑，陰生植物中葉綠素a/b的值要高于陽生植物[22]。范燕萍等[9]報道墨蘭3個葉片綠黃組成的花葉線藝蘭品種金嘴、陽明錦和大石門葉片色素組成，表明線藝蘭葉斑的形成與葉綠素的質量分數(shù)有直接的關系。本實驗結果表明葉藝植株表觀呈現(xiàn)的綠色面積與葉綠素含量一致，這可能由于葉藝藝象程度較高植株的葉綠素分解速度超過了合成速度；同時葉藝藝象最高植株TRIR-3的葉綠素a/b值高，表明在栽培生長過程中，葉藝藝象最高植株TRIR-3較TRIR-1和TRIR-2植株耐陰。

可溶性糖和可溶性蛋白是多種植物的滲透調節(jié)劑，也是高等植物的主要代謝產物之一[23]?？扇苄蕴羌仁歉叩戎参锏闹饕夂袭a物，又是碳水化合物代謝和暫時貯藏的主要形式，在植物碳代謝中占有重要位置，可溶性糖的變化大致反映了該植株的碳素營養(yǎng)代謝狀況。本實驗結果表明葉片上的綠色與白色相間，面積基本對等的TRIR-2組培苗，增強了光合產物可溶性糖的合成；而全綠TRIR-1植株更利于促進蛋白質的合成。這可能是由于植株發(fā)生誘變時誘發(fā)植物體內的自由基，導致植物體內蛋白質和脂類等物質聚合，交聯(lián)和過氧化作用使它們的結構功能發(fā)生變化，引起植物的生理功能發(fā)生變化[24]。

圖3輻射誘變的葉藝蘭MDA(A)和H2O2(B)及SOD(C)、POD(D)、CAT(E)和APX(F)活性

Fig.3MDA(A)，H2O2(B)，SOD(C)，POD(D)，CAT(E) and APX (F)of irradiation cymbidium with verge line pattern leaves

綠色植物在進行光合作用時，由于光合電子傳遞鏈總會發(fā)生一定程度的電子泄漏，將電子傳遞給分子O2，從而產生ROS，當細胞內的防御系統(tǒng)無法阻止ROS自增長的自動氧化反應時，細胞將受傷和死亡[25]。MDA是膜脂過氧化產物之一，當植物處于逆境脅迫時，膜脂過氧化加重，MDA含量增加，它是一個反映膜脂過氧化傷害的重要指標[26～27],H2O2是植物葉綠體中光合電子傳遞鏈和某些酶反應的天然產物，是具有毒害作用的活性氧[28]。SOD、POD、CAT及APX是植物抗氧化酶，是防御膜脂過氧化的主要酶[29～30],主要作用是清除植株體內的活性氧自由基，當其作用失衡時將會導致膜質過氧化產物的積累[31],研究表明MDA、O2-和H2O2等活性氧自由基含量與細胞內清除活性氧的保護系統(tǒng)呈負相關[32]。本實驗結果表明，隨著葉藝藝象程度的增加，葉藝蘭株的MDA和H2O2含量顯著增強。說明輻射誘變的葉藝蘭生產了逆境脅迫，并且隨著葉藝藝象程度的增加，同時葉藝蘭株在逆境中能通過抗氧化酶有效地清除活性氧，來應對活性氧累積造成的傷害。

4　結論

60Coγ輻射誘發(fā)了葉藝蘭的產生，并且葉藝蘭株系在形態(tài)特征和生理特性方面表現(xiàn)出了與野生型明顯的差異性，有利于葉藝蘭新品種的選育，同時為指導蘭屬其他種和變種的人工葉藝新品系的育成奠定基礎。

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Morphology and Physiological Characteristics of Cymbidium tracyanum×C.Iridioides D.Don with Variegation Leaves Induced by Irradiation

SU Chang，LI Zhi-lin，REN Zhi-hui，WANG Yu-ying

(Yunnan Agricultural University College of Horticulture and Landscape,Kunming Yunnan 650201,P.R.China)

For expounding to expound the production mutants ofCymbidiuminduced by irradiation,the tissue culture seedlings ofCymbidiumtracyanum×C.iridioidesD.Don were irradiated by60Coγ-rays,and the new mutant TRIR-2 and TRIR-3 were selected through 6-generation observation.The results showed that:(1) With the degree of verge line pattern leaves increased，the heights，biomass，leaf length，leaf width and root length of the seedlings decreased except the number of root，but the number of leaf increased.(2)The seedlings of verge line pattern leaves enhanced the synthesis of soluble sugar，and the all green seedlings were more inclined to the synthesis of soluble protein during photosynthesis.(3) When the verge line pattern leaves was more obvious，the content of chlorophyll，and the utilization and adjustment ability of light energy became lower，while the damage of membrane lipid peroxidation was more serious，but the seedlings could response by adjusting the antioxidation enzyme activity.Research suggests thatCymbidiumwith verge line pattern leaves induced by irradiation，and could breed new variety.

irradiation；Cymbidiumwith variegation leaves;morphological characteristics;physiological characteristics;60Coγ-rays;induce

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.03.007

2015-11-16

國家自然科學基金項目(30160074)，云南省自然科學基金重點項目(2002C0003P)，云南省重點新產品開發(fā)項目(2012BB008)，

蘇暢(1989-)，女，碩士研究生，主要從事園藝植物資源的利用及創(chuàng)新研究。E-mail:515718100@qq.com

簡介：王玉英(1980-),女，講師，博士，碩士生導師，主要從事植物資源的利用和創(chuàng)新研究。E-mail:wyysxp@126.com

S 682.31

A

1672-8246(2016)03-0038-06

云南農業(yè)大學園林園藝學院院級基金(2014001),云南省昆明市科學技術局重點項目(2015-1-N-00984)。