陳曦　李秋霞　魏秋靜　古潔若

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·基礎(chǔ)研究論著·

CD14在強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞和血清中的表達(dá)研究

陳曦李秋霞魏秋靜古潔若

目的研究CD14基因在強(qiáng)直性脊柱炎(AS)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中RNA，和血清中蛋白的表達(dá)情況，并對(duì)CD14基因進(jìn)行相關(guān)性分析。方法采集病情活動(dòng)期AS患者的靜脈血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)后提取RNA，同時(shí)從靜脈血中離心分離血清于-20℃保存。其中21例AS活動(dòng)期患者和20名健康志愿者的外周血行Microarray芯片檢測(cè)。使用ELISA法檢測(cè)另外40例活動(dòng)期AS患者和40名健康志愿者血清中CD14的含量。對(duì)結(jié)果基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，探討其參與AS發(fā)病的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果Microarray芯片檢測(cè)CD14在AS患者PBMC中mRNA的表達(dá)的熒光強(qiáng)度值為6 824±1 449，健康對(duì)照組為4 027±923。ELISA法檢測(cè)AS患者血清中CD14蛋白含量中位數(shù)為2 568 kU/L，健康對(duì)照組為 905 kU/L。CD14在AS患者PBMC中mRNA和血清中蛋白的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組(P均<0.05)。CD14主要參與了Toll樣受體(TLR)信號(hào)途徑和固有免疫信號(hào)途徑。STRING10在線蛋白質(zhì)分析提示CD14和MYD88、TLR2、TLR6等基因相關(guān)。結(jié)論CD14可能通過參與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的通路參與了AS的發(fā)病過程。

強(qiáng)直性脊柱炎；CD14；血清；外周血單個(gè)核細(xì)胞

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種常見的全身性慢性炎癥性疾病，以骶髂關(guān)節(jié)炎、肌腱端炎和脊柱炎為特點(diǎn)，病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者功能喪失和殘疾。AS的發(fā)病與促炎細(xì)胞因子表達(dá)的上調(diào)有關(guān)，其中最重要并為多數(shù)學(xué)者所公認(rèn)的細(xì)胞因子是TNF-α[1-4]。CD14分子在激活固有免疫系統(tǒng)、細(xì)菌吞噬作用和清除凋亡細(xì)胞等各種免疫反應(yīng)中起重要作用。CD14/Toll樣受體 4(TLR 4)-核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制。CD14/TLR 4-NF-κB信號(hào)通路過度活化，下游NF-κB p65及基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)的表達(dá)升高可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞、降解加速，是誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的重要因素之一[5]。本課題組在2009年用Microarray芯片對(duì)未分化脊柱關(guān)節(jié)病患者及健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)差異基因，經(jīng)過實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)驗(yàn)證后證實(shí)有4個(gè)基因與Microarray芯片結(jié)果相符[6]。本研究重新對(duì)該Microarray芯片進(jìn)行了分析，使用ELISA法在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合AS發(fā)病機(jī)制的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入Microarray芯片和ELISA研究的AS患者均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院門診或住院患者，健康對(duì)照組血液標(biāo)本均取自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院健康體檢者，所有受試對(duì)象均知情同意并自愿參與本研究。Microarray芯片研究中，AS患者的男女比為13∶8，年齡(35±9)歲；健康對(duì)照者的男女比為10∶10，年齡(37±9)歲。ELISA研究中，AS患者的男女比為33∶7，年齡(31±12)歲；健康對(duì)照者的男女比為33∶7，年齡(30±9)歲。AS患者均符合1984年修訂的AS紐約診斷標(biāo)準(zhǔn)，該組患者均處在疾病活動(dòng)期，Bath AS病情活動(dòng)指數(shù)(BASDAI)>4分，或ESR升高或CRP升高。納入Microarray實(shí)驗(yàn)組AS患者的BASDAI為4.6(2.6，7.8)分；納入ELISA實(shí)驗(yàn)組的患者BASDAI為5.0(2.9，8.2)分。AS組與健康對(duì)照組的性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。排除合并其他自身免疫性疾病、肝腎疾病、感染、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病等。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

二、主要試劑與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用PrimeScriptRTMaster Mix (Perfect Real Time)(日本Takara公司)。微陣列芯片(Sentrix Human Ref- 8_v2 Beadchips，美國(guó)Illumina公司)；Human sCD14 Quantikine ELISA Kit(1 KT) DC140(美國(guó)R&D公司)試劑盒。人外周血淋巴細(xì)胞分離液(TBD，LTS1077-1，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；Axon GenePix激光掃描儀(美國(guó)Axon公司)；KEGG、STRING蛋白分析在線數(shù)據(jù)庫(kù)；GenClip 2.0(Human Gene Function And Network Analysis)基因和蛋白在線分析軟件。

三、實(shí)驗(yàn)方法

使用EDTA抗凝管收集入組者外周靜脈血樣本，分離PBMC，使用Trizol法提取總RNA。將提取出的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，并使用包含全基因組20 589個(gè)探針的微陣列芯片對(duì)21例AS患者和20名健康受試者進(jìn)行檢測(cè)。使用ELISA試劑盒對(duì)40例AS患者與40名健康體檢者CD14分子進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)按照說明書步驟操作。

四、Microarray芯片的分析

將芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用芯片分析軟件Array tool 2.0中的微陣列顯著性(SAM)分析法和基因組表達(dá)比較法對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，隨后挑選出SAM分析法中fold值大于1.5(AS患者組中表達(dá)下調(diào))和小于0.66(AS患者組中表達(dá)上調(diào))的基因，并選擇基因組表達(dá)比較法中P值小于0.0001的基因。通過文獻(xiàn)查閱、京都基因與基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)的路徑分析和使用GenClip 2.0在線蛋白質(zhì)分析軟件的人類基因功能和網(wǎng)絡(luò)分析功能對(duì)CD14相關(guān)的信號(hào)通路進(jìn)行分析[7]。利用STRING10在線蛋白質(zhì)分析軟件分析CD14的相關(guān)基因，并結(jié)合已知的CD14/TLR 4-NF-κB-TNF-α信號(hào)通路總結(jié)可能的CD14-TLR-NF-κB-TNF-α的信號(hào)通路[8-11]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、Microarray芯片分析結(jié)果

經(jīng)模板DNA芯片數(shù)據(jù)比對(duì)后，共篩選出63個(gè)差異基因(fold<0.66或fold>1.5，P均<0.001)。AS組的熒光強(qiáng)度值為6 824±1 449，是健康對(duì)照組(4 027±923)的1.69倍，2組Microarray芯片中CD14熒光強(qiáng)度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.330，P<0.001)。

二、ELISA分析結(jié)果

AS組和健康對(duì)照組PBMC的CD14含量分別為2 568(965，4 490)、905(477，1 269)kU/L，AS組患者PBMC的CD14含量是對(duì)照組的2.83倍，2組PBMC的CD14含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.393，P=0.017)。

三、CD14分子參與AS相關(guān)信號(hào)通路的分析結(jié)果

CD14主要參與了Toll樣受體信號(hào)途徑和固有免疫信號(hào)途徑。STRING10在線蛋白質(zhì)分析提示CD14和MYD88、TLR2、TLR6等基因相關(guān)(圖1)，可能的CD14-TLR-NF-κB-TNF-α信號(hào)通路見圖2。

圖1　與CD14相關(guān)的蛋白分子相互作用示意圖

LBP：脂多糖結(jié)合蛋白；MYD88：髓系分化因子88；TLR1:Toll樣受體1；TLR2：Toll樣受體2；TLR4：Toll樣受體4；TLR6：Toll樣受體6；LY96：淋巴細(xì)胞抗原96；ITGAM：整合素αM；ITGB2：整合素β2

討　　論

AS的典型病理變化是從最初的炎癥階段進(jìn)展到骨化強(qiáng)直階段，最終發(fā)生關(guān)節(jié)融合，其中最重要的炎癥因子是TNF-α。TNF-α作為炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，在AS的骨代謝病理過程中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期和非活動(dòng)期的中國(guó)AS患者血清TNF-α水平均明顯高于健康人，活動(dòng)期者較非活動(dòng)期者升高得更明顯[12-13]。目前AS具體的炎癥過程仍正在研究中。其中介導(dǎo)固有免疫的TLR家族在AS的發(fā)病過程中起著重要作用。本課題組前期研究結(jié)果表明，TLR2與TLR4的mRNA和蛋白的表達(dá)水平在AS患者中均高于健康人，并且與AS的疾病活動(dòng)度評(píng)分呈線性關(guān)系[14]。TLR2、TLR4、TLR6的激活均需要CD14分子的參與， 并繼而激活NF-κB，產(chǎn)生TNF-α等炎癥因子，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[8-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，無論是在AS患者的PMBC還是在血清中，CD14水平均比健康人升高。

CD14是脂多糖受體，可介導(dǎo)脂多糖對(duì)單核細(xì)胞的刺激并分泌TNF、IL-1等細(xì)胞因子，介導(dǎo)一系列生理(增強(qiáng)免疫反應(yīng)性)和病理(炎癥)反應(yīng)[15]。

圖2　CD14-TLR-NF-κB-TNF-α信號(hào)通路示意圖

Lipoproteins：脂蛋白類；Mannans：甘露聚糖類；Lipopolysaccharides：脂多糖；MYD88：髓系分化因子88；TRAF6：TNF受體相關(guān)因子6；IKKα：IκB激酶α；IKKβ：IκB激酶β；IKKγ：IκB激酶γ

CD14 被證實(shí)是脂多糖激活內(nèi)在免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而激活 NF-κB 所必需的細(xì)胞因子，而 CD14的活化是炎癥反應(yīng)的共同途徑[16]。在風(fēng)濕性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、SLE和干燥綜合征的研究中，已證實(shí)無論是單核細(xì)胞表面的CD14還是可溶性CD14的水平均和疾病的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系[17-20]。CD14和AS相關(guān)性的研究目前國(guó)內(nèi)較少，以 “ankylosing spondylitis and CD14”為關(guān)鍵詞在Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索，結(jié)果有18篇文獻(xiàn)，其中僅3篇文獻(xiàn)的研究?jī)?nèi)容是關(guān)于AS和CD14的，而且研究也不夠深入，多是關(guān)于CD14多態(tài)性和其在細(xì)胞表面表達(dá)情況的觀察[21-23]。聯(lián)系到CD14-TLR-NF-κB-TNF-α信號(hào)通路，結(jié)合AS的發(fā)病特點(diǎn)，筆者推測(cè)CD14與炎癥和TNF-α的產(chǎn)生相關(guān)，參與了AS的發(fā)病過程。

Microarray 芯片實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)都是高通量的，對(duì)高通量數(shù)據(jù)的分析大多是采用數(shù)據(jù)的批量導(dǎo)入，很少對(duì)單個(gè)基因的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因?yàn)樗褂玫姆治鲕浖皡?shù)不同，分析結(jié)果有可能會(huì)有大同小異的結(jié)果，也可能會(huì)遺漏某些有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。本研究通過高通量數(shù)據(jù)的批量分析結(jié)合單個(gè)基因的數(shù)據(jù)單獨(dú)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了CD14在AS患者外周血PBMC的mRNA和血清中蛋白表達(dá)水平均有升高，與健康對(duì)照者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，彌補(bǔ)了既往數(shù)據(jù)分析的遺漏，找到了一個(gè)有意義的生物標(biāo)記分子，為日后的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

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Expression of CD14 in peripheral blood mononuclear cells and serum of patients with ankylosing spondylitis

ChenXi,LiQiuxia,WeiQiujing,GuJieruo.

DepartmentofRheumatism,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,GuJieruo

ObjectiveTo measure the expression level of CD14 mRNA in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and CD14 protein in the serum of patients with ankylosing spondylitis (AS) and to perform correlation analysis of CD14 gene. MethodsThe venous blood samples were obtained from patients with active AS, PBMCs were isolated and RNA was extracted subsequently. The serum was isolated from the venous blood samples by centrifuge and restored at -20 ℃. The peripheral blood samples collected from 21 patients with active AS and 20 healthy volunteers were detected by the microarray chip. Using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the expression of CD14 protein in the serum of 40 patients with active AS and 40 healthy volunteers was detected for verification. The signaling pathway of the related genes was analyzed to investigate the mechanism underlying the pathogenesis of AS. ResultsMicroarray chip detected that the fluorescent intensity of CD14 mRNA in the PBMC of AS patients was 6 824±1 449, significantly higher compared with 4 027±923 in the healthy controls (P<0.05). ELISA demonstrated that the median level of CD14 protein in the serum of AS patients was calculated as 2 568 kU/L, significantly higher than 905 kU/L in the healthy controls (P<0.05). CD14 mainly participated in the Toll-like receptor and inherent immune signaling pathways. STRING 10 hinted that CD14 was correlated with MYD88, TLR2 and TLR6, etc. ConclusionCD14 is probably involved with the pathogenesis of AS via participating in the signaling pathways related to immune and inflammatory response.

Ankylosing spondylitis; CD14; Serum; Peripheral blood mononuclear cell

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.09.004

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

，古潔若

2016-06-05)(本文編輯：林燕薇)