王貽兵,劉　丹,王佳賀

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JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡中的作用

王貽兵a*,劉丹b,王佳賀b

目的探討巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的人前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞凋亡以及JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在此過程中的作用。方法不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B處理人前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞0、24、48、72 h后，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)PC-3細(xì)胞存活率；采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3細(xì)胞凋亡率；Western blot分析檢測(cè)巖大戟內(nèi)酯B作用不同時(shí)間后JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)；預(yù)先用不同濃度的JSI-124(選擇性STAT3途徑抑制劑)處理PC-3細(xì)胞60 min，觀察巖大戟內(nèi)酯B作用不同時(shí)間后PC-3細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果巖大戟內(nèi)酯B能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡，降低磷酸化-JAK2/STAT3的表達(dá)，JSI-124可以提高巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡率。結(jié)論JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡過程。JSI-124通過特異性地抑制STAT3活性提高了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡率。

巖大戟內(nèi)酯B；前列腺癌；PC-3細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

0　引言

前列腺癌好發(fā)于中老年男性，已成為危害男性生命的重要疾病之一。近年來，隨著我國人口老齡化及經(jīng)濟(jì)水平的提高，前列腺癌的發(fā)病率亦逐年上升[1]。狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud)為大戟科植物，含有多種化學(xué)成分，巖大戟內(nèi)酯B(Jolkinolide B)廣泛存在于狼毒大戟中，屬二萜類[2]。研究發(fā)現(xiàn)，巖大戟內(nèi)酯B具有廣泛的抗腫瘤活性[3-5]，能夠誘導(dǎo)白血病、乳腺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞凋亡。然而關(guān)于巖大戟內(nèi)酯B能否誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制的研究較少。本研究探討了巖大戟內(nèi)酯B對(duì)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞凋亡和JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以進(jìn)一步探討巖大戟內(nèi)酯B治療前列腺癌的機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;Bcl-2、Bax抗體、磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3抗體及其他試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國Backman公司；離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司。PC-3細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將PC-3細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3巖大戟內(nèi)酯B作用于PC-3細(xì)胞當(dāng)巖大戟內(nèi)酯B的濃度分別為0、30、60 及120 μg/mL時(shí)，分別與PC-3 細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48及72 h。

1.4細(xì)胞活力測(cè)定采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B分別與人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48及72 h后，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色5 min，在顯微鏡下觀察。其中，死細(xì)胞染成藍(lán)色。計(jì)數(shù)未染色的細(xì)胞數(shù)和總的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活率為未染色的細(xì)胞占總的細(xì)胞的百分率。

1.5AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC-3細(xì)胞的凋亡情況收集對(duì)數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，加入不同濃度的巖大戟內(nèi)酯B，分別作用0、24、48及72 h后，收集細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)PC-3細(xì)胞的濃度為5×105個(gè)/mL，用500 μL 的Binding Buffer 將PC-3細(xì)胞重懸，先加入5 μL AnnexinV-FITC，再加入5 μL Propidium iodide(PI)混勻，4 ℃避光結(jié)合15 min后，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定PC-3細(xì)胞的凋亡率。

1.6Western blot檢測(cè)磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表達(dá)巖大戟內(nèi)酯B分別處理PC-3 細(xì)胞0、24、48及72 h，提取總蛋白。檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量。等量蛋白用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳。電泳條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。用2%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗(兔抗人非磷酸化-JAK2、非磷酸化-STAT3以及磷酸化-JAK2、磷酸化-STAT3、Bcl-2、Bax、β-actin)，4 ℃過夜。TBST (含0.1% Tween 20-Tris 緩沖液)洗膜 2 次，每次15 min；加入稀釋后的羊抗兔 IgG 二抗(稀釋比例為1∶6 000)，室溫條件下反應(yīng) 1 h；洗膜后按PIERCE 化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書，進(jìn)行蛋白條帶的灰度值檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞活力測(cè)定臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巖大戟內(nèi)酯B的濃度逐漸升高及作用時(shí)間逐漸延長時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組被染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量亦逐漸增多,提示壞死的PC-3細(xì)胞逐漸增多,并且?guī)r大戟內(nèi)酯B對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性，見圖1。

圖1　巖大戟內(nèi)酯B對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3生長的影響

2.2流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系PC-3細(xì)胞凋亡分別以0、30、60及120 μg/mL濃度的巖大戟內(nèi)酯B作用于前列腺癌細(xì)胞系PC-3不同時(shí)間后，細(xì)胞均發(fā)生凋亡，并且呈濃度及時(shí)間依賴性。當(dāng)巖大戟內(nèi)酯B濃度為30、60及120 μg/mL時(shí)，作用48 h后，PC-3細(xì)胞的凋亡率與0 μg/mL相比，以及當(dāng)巖大戟內(nèi)酯B濃度為60 μg/mL 時(shí)，分別作用24、48及72 h后，PC-3細(xì)胞的凋亡率與0 h相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)。結(jié)果見圖2。

圖2　Annexin V FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)前

2.3巖大戟內(nèi)酯B對(duì)磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3以及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響巖大戟內(nèi)酯B作用不同時(shí)間后，免疫印跡法檢測(cè)磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)巖大戟內(nèi)酯B作用PC-3細(xì)胞0、24、48及72 h后，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表達(dá)水平隨著巖大戟內(nèi)酯B作用時(shí)間的延長逐漸下降，提示巖大戟內(nèi)酯B可抑制JAK2/STAT3的活化。同時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著巖大戟內(nèi)酯B作用時(shí)間的延長，促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)水平逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)逐漸下降(圖3)。

2.4STAT3抑制劑JSI-124對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響預(yù)先用不同濃度的JSI-124處理PC-3細(xì)胞60 min，觀察巖大戟內(nèi)酯B作用不同時(shí)間后PC-3細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，PC-3細(xì)胞的凋亡率隨著JSI-124濃度的增加而逐漸升高。

圖3　巖大戟內(nèi)酯B對(duì)JAK-STAT3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

3　討論

研究表明，腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的失調(diào)控是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為治療腫瘤的主要手段之一[6-7]。但目前誘導(dǎo)腫瘤凋亡的西藥多因合并嚴(yán)重的不良反應(yīng)而使其臨床應(yīng)用受到了限制。因此，從中藥中提取高效低毒的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為國內(nèi)外研發(fā)新藥的重要途徑[8]。藥理學(xué)研究證實(shí)，巖大戟內(nèi)酯B具有抗白血病、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的作用，其機(jī)制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤組織生長等[9-10]。但是，關(guān)于巖大戟內(nèi)酯B如何誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制，目前研究較少。

凋亡是一個(gè)高度復(fù)雜的、嚴(yán)格的細(xì)胞程序性死亡的過程，是細(xì)胞自身的一種受促凋亡因子和抑制凋亡因子共同調(diào)節(jié)的生理性死亡機(jī)制[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：巖大戟內(nèi)酯B能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制PC-3細(xì)胞增殖，并且呈時(shí)間及劑量依賴性。

Bcl-2、Bax在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起非常關(guān)鍵的作用。Bax促進(jìn)凋亡，而Bcl-2的作用與之相反[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著巖大戟內(nèi)酯B作用時(shí)間的延長，Bax的表達(dá)水平逐漸升高，而Bcl-2的表達(dá)逐漸下降，進(jìn)一步證實(shí)巖大戟內(nèi)酯B能夠誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。STAT3是轉(zhuǎn)錄因子STAT 家族的成員，同時(shí)也是表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)下游信號(hào)通路JAK-STAT3的關(guān)鍵因子[14-15]。磷酸化-STAT3(p-STAT3)可作用于細(xì)胞核內(nèi)特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)，直接或間接上調(diào)Bcl-2、Bcl-XL和cyclin D1/D2等抑制凋亡的基因的表達(dá)[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表達(dá)隨巖大戟內(nèi)酯B作用時(shí)間延長明顯下降，說明JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。加入不同濃度的STAT3抑制劑JSI-124后，隨著JSI-124濃度的逐漸增加，PC-3細(xì)胞的凋亡率亦逐漸升高。提示JSI-124通過特異性地抑制STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡率。進(jìn)一步證明了JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了巖大戟內(nèi)酯B誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡過程。

綜上所述，巖大戟內(nèi)酯B能夠抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與巖大戟內(nèi)酯B下調(diào)PC-3細(xì)胞磷酸化JAK2/STAT3的表達(dá)，繼而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

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Effect of JAK2/STAT3 signaling transduction on the apoptosis of PC-3 cells of prostate cancer induced by Jolkinolide B

WANG Yi-binga*,LIU Danb,WANG Jia-heb

(a.Department of Urinary Surgery，b.Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004, China)

ObjectiveTo investigate the role of the JAK2/STAT3 pathway in the apoptosis of prostate cancer PC-3 cells induced by Jolkinolide B,a bioactive diterpene isolated from the roots ofEuphorbiafischerianaSteud.MethodsThe PC-3 cells were treated with different doses of Jolkinolide B at different time points.Growth inhibition was analyzed by trypan blue stain.Cell apoptosis of PC-3 cells was detected by Annexin V-FITC/PI staining.Expression of JAK2/STAT3 was detected by Western blot.In some experiments,PC-3 cells were pretreated with JSI-124(an inhibitor for STAT3),and the apoptosis rates of PC-3 cells were detected.ResultsWe found that Jolkinolide B reduced cell viability and induced apoptosis in a dose- and time- dependent manner in PC-3 cells.The induction of apoptosis was accompanied by the down-regulation of phosphorylation-JAK2/STAT3.Moreover,we observed that JSI-124 treatment resulted in apoptosis of PC-3 cells.ConclusionThe signaling pathway JAK2/STAT3 participates in the apoptosis of PC-3 cells induced by Jolkinolide B.JSI-124 increases PC-3 cell apoptosis induced by Jolkinolide B by inhibiting the activity of JAK2/STAT3.

Jolkinolide B;Prostate cancer;PC-3 cells;Apoptosis

2016-07-07

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院a.泌尿外科，b.老年病科， 沈陽110004

遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013225086);國家自然基金青年基金項(xiàng)目(81101224);盛京自由研究者計(jì)劃項(xiàng)目(201206)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609002