楊江華，楊國(guó)良，潘麒，薄雋杰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海200217)

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Rv0652蛋白對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響

楊江華，楊國(guó)良，潘麒，薄雋杰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海200217)

目的觀察結(jié)核桿菌屬PE_PGRS蛋白家族成員Rv0652對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響。方法 在96孔板中接種膀胱癌T24、J82、RT4細(xì)胞懸液，每孔100 μL，含相應(yīng)膀胱癌細(xì)胞5 000個(gè)。設(shè)空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組，分別加入DMEM培養(yǎng)液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液，12、24、36、48 h采用CCK-8試劑盒測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。另取膀胱癌T24、J82、RT4細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組，分別加入DMEM培養(yǎng)液10 mL、含體外重組Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后采用PI和FITC- Annexin V雙染色，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Rv0652蛋白組、卡介苗組膀胱癌細(xì)胞RT4、J82、T24增殖率逐漸下降(P均<0.05)；相同培養(yǎng)時(shí)間Rv0652蛋白組、卡介苗組細(xì)胞增殖率相比，P均>0.05。Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P均<0.05)；Rv0652蛋白組、卡介苗組相比，P均>0.05。結(jié)論 Rv0652蛋白能抑制膀胱癌細(xì)胞T24、J82、RT4增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，效果與卡介苗類似。

膀胱癌；膀胱癌細(xì)胞；Rv0652蛋白；卡介苗；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

膀胱內(nèi)灌注化療藥物(如吉西他濱、吡柔比星、絲裂霉素等)或免疫治療藥物(如卡介苗)有助于降低經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TURBT)后非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的復(fù)發(fā)率[1，2]，但仍有30%的患者術(shù)后經(jīng)卡介苗膀胱灌注治療無(wú)效，70%接受卡介苗膀胱灌注治療的患者會(huì)發(fā)生不良反應(yīng)[3，4]。Rv0652蛋白是從結(jié)核分枝桿菌中分離出的蛋白，是結(jié)核桿菌PE_PGRS蛋白家族成員[5]。Rv0652蛋白在活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)能誘導(dǎo)很強(qiáng)的抗體反應(yīng)，同時(shí)可激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)TNF及MCP-1生成[6]。Rv0652還能通過(guò)結(jié)合Toll樣受體4(TLR4)誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞分化成熟，產(chǎn)生TNF、IL-6等炎癥因子，激活MyD88和TRIF信號(hào)通路[7,8]。這些信號(hào)通路及細(xì)胞因子均與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。故我們推測(cè)Rv0652有可能產(chǎn)生與卡介苗類似的抗膀胱腫瘤效應(yīng)。2015年9月～2016年3月，我們觀察了Rv0652蛋白對(duì)膀胱癌細(xì)胞T24、J82、RT4增殖與凋亡的影響，并與卡介苗進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與材料膀胱癌細(xì)胞系T24、J82、RT4購(gòu)自上海國(guó)標(biāo)生物科技有限公司。CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；PI-AnnexinV購(gòu)自美國(guó)BD公司；DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，青霉素、鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。膀胱灌注用卡介苗購(gòu)自日本伯川公司。Rv0652蛋白采用文獻(xiàn)[4]方法獲取。

1.2Rv0652蛋白、卡介苗對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響觀察采用CCK8法。在96孔板中接種膀胱癌T24、J82、RT4細(xì)胞懸液，每孔100 μL，含相應(yīng)膀胱癌細(xì)胞5 000個(gè)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液。設(shè)空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組，分別加入DMEM培養(yǎng)液100 μL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液，分別于12、24、36、48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的光密度值(OD值)。每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算Rv0652蛋白組和卡介苗組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(處理組OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.3Rv0652蛋白、卡介苗對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響觀察采用PI-AnnexinV法。膀胱癌T24、J82、RT4細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。設(shè)空白組、Rv0652蛋白組和卡介苗組，分別加入DMEM培養(yǎng)液10 mL、含Rv0652 10 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液、含卡介苗1 mg/μL的DMEM培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PI和FITC- Annexin V雙染色，然后用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1Rv0652蛋白組、卡介苗組細(xì)胞增殖率比較隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細(xì)胞增殖率逐漸下降(P均<0.05)；相同培養(yǎng)時(shí)間Rv0652蛋白組、卡介苗組細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1　不同培養(yǎng)時(shí)間Rv0652蛋白組、卡介苗組的膀胱癌RT4、J82、T24細(xì)胞增殖率比較

注：與同組同類細(xì)胞培養(yǎng)12 h相比，*P<0.05；與同組同類細(xì)胞培養(yǎng)24 h相比，#P<0.05；與同組同類細(xì)胞培養(yǎng)36 h相比，△P<0.05。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P均<0.05)；Rv0652蛋白組、卡介苗組相比，P均>0.05。詳見(jiàn)表2。

表2　各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與對(duì)照組同類細(xì)胞相比，*P<0.05。

3　討論

在我國(guó)，膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其主要診斷和治療手段是TURBT術(shù)，但膀胱腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率超過(guò)50%，一部分患者會(huì)進(jìn)展至肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[7]。為了減少膀胱癌的術(shù)后復(fù)發(fā)，臨床推薦患者術(shù)后進(jìn)行膀胱灌注治療[8]。其中卡介苗是高危非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌治療的首選藥物[9]。已有研究[10]表明，卡介苗可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡，然而卡介苗是減毒活菌制劑，不良反應(yīng)較多[11,12]。卡介苗治療的全身不良反應(yīng)有發(fā)熱、全身不適、結(jié)核菌敗血癥、肺部結(jié)核感染、肝臟毒性、全身皮疹等[13,14]；局部不良反應(yīng)有化學(xué)性膀胱炎、尿頻、膀胱攣縮、肉芽腫性前列腺炎等[15，16]。上述不良反應(yīng)限制了卡介苗在膀胱癌治療中的臨床應(yīng)用。

Rv0652蛋白是從結(jié)核分枝桿菌中分離出的蛋白，是結(jié)核桿菌PE_PGRS蛋白家族成員之一。結(jié)核桿菌PE蛋白家族這是一組富含甘氨酸和丙氨酸的酸性蛋白家族，它們的氨基末端附近都含有脯氨酸-谷氨酸基序。該家族蛋白質(zhì)編碼基因包含稱為PGRS的多拷貝串聯(lián)重復(fù)序列，在基因組中成簇散在分布。PE家族的PGRS片段與EB病毒的EB病毒核抗原1(EBNA-1)序列具有明顯同源性。已有研究[4]表明Rv0652可通過(guò)TLR4和MyD88激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成熟，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，其中包括TNF和MCP-1。此外，Rv0652被TLR4識(shí)別后可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟分化，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放[6]。Rv0652還可能激活Fas/FasL途徑引起細(xì)胞凋亡。我們推測(cè)Rv0652可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡。本研究結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細(xì)胞增殖率逐漸下降；Rv0652蛋白組、卡介苗組RT4、J82、T24細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組。本研究結(jié)果印證了上述猜測(cè)。

Rv0652蛋白抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡可能涉及多種機(jī)制。一方面，Rv0652作為單體蛋白質(zhì)可直接結(jié)合細(xì)胞膜，影響膜流動(dòng)性，從而影響細(xì)胞活力。同時(shí)Rv0652與膀胱癌細(xì)胞系T24、J82、RT4結(jié)合后，激活Fas/FasL通路，引起Caspase-8的活化，從而引起膀胱癌細(xì)胞凋亡。此外，Rv0652可通過(guò)結(jié)合TLR4誘導(dǎo)大量炎癥因子釋放，包括TNF-α等，可能激活依賴TNF-α的凋亡信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Rv0652抑制膀胱癌細(xì)胞系增殖、促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡的效果與卡介苗類似，而且Rv0652作為單體蛋白質(zhì)，不具有卡介苗完整的菌體，可以減小卡介苗引起的全身感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，避免了卡介苗的不良反應(yīng)，值得參考應(yīng)用。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372188)。

薄雋杰(E-mail: renjibojj@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.011

R737.14

A

1002-266X(2016)31-0037-03

2016-04-15)