沙菁　 石鴻佼　 徐　冰

(東南大學(xué)江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計與制造重點實驗室, 南京 211189)(東南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院, 南京 211189)

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LiCl溶液中基于固態(tài)納米孔的DNA檢測

(東南大學(xué)江蘇省微納生物醫(yī)療器械設(shè)計與制造重點實驗室, 南京 211189)(東南大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院, 南京 211189)

采用陽離子體積較小的LiCl溶液作為緩沖液,研究DNA在不同濃度下通過固態(tài)納米孔時的行為特征,以探究DNA的過孔機(jī)理.實驗結(jié)果表明,當(dāng)LiCl溶液濃度從0.1mol/L變化到1.0mol/L時,由DNA過孔所引起的相對阻塞離子電流信號比值從0.014 42降低至0.002 79,而DNA完全通過納米孔所需時間從0.30ms增加至1.87ms.對比1mol/LKCl,NaCl,LiCl三種溶液中DNA的過孔結(jié)果發(fā)現(xiàn),在LiCl溶液中DNA的過孔時間分別為KCl,NaCl溶液中的6.2和5.3倍,說明LiCl溶液能夠有效降低DNA的過孔速度.此外,實驗發(fā)現(xiàn)LiCl溶液中DNA主要以線性非折疊和折疊2種形態(tài)過孔． 因此,增加LiCl溶液濃度可延長DNA的過孔時間,但會使相對阻塞離子電流信號幅值降低.

納米孔;LiCl溶液;DNA;阻塞離子電流;過孔時間

納米孔測序技術(shù)是下一代基因測序技術(shù)中最可行的技術(shù)方案之一,主要是通過物理方法直接對DNA序列進(jìn)行讀取.納米孔測序技術(shù)的原理可以簡單描述為: 單個生物分子通過充滿離子溶液的納米孔通道時,會引起通道內(nèi)電學(xué)性質(zhì)的變化,通過分析離子電流的阻塞信號,可實現(xiàn)單分子檢測,甚至是DNA中4種堿基的辨識[1].納米孔測序技術(shù)具有結(jié)構(gòu)簡潔、速度快、操作簡便等特點,故而得到了廣泛的關(guān)注[2].

目前,固態(tài)納米孔大都利用硅及其衍生物制造而成,一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面加工出納米尺度的孔徑,再進(jìn)一步對孔的形狀和大小進(jìn)行修飾.與生物納米孔相比,固態(tài)納米孔具有高穩(wěn)定性、孔徑大小和通道長度可控、可調(diào)節(jié)的表面特性以及可與設(shè)備結(jié)合的優(yōu)勢[3-5].

納米孔測序技術(shù)的關(guān)鍵在于對DNA穿過納米孔機(jī)理的分析,即對DNA通過納米孔所引起的阻塞離子電流信號進(jìn)行辨識檢測.對過孔信號起主要影響作用的是緩沖溶液中的正離子,目前的實驗研究一般在KCl或NaCl溶液中進(jìn)行,但K+和Na+的離子半徑較大,與DNA表面的吸附力不強(qiáng),在DNA通過納米孔時容易脫落[6].為了深入研究納米孔的過孔機(jī)理,本文將LiCl溶液作為緩沖液,研究了不同溶液濃度下DNA通過Si3N4納米孔的行為特征.

1　實驗材料和方法

1.1納米孔的制備

本實驗使用了Si3N4固態(tài)納米孔.其加工步驟如下: ① 利用低壓化學(xué)氣相沉積技術(shù),在2.5mm×2.5mm×0.4mm的硅基底上沉積一層100nm厚的Si3N4薄膜.② 采用光刻技術(shù)和反應(yīng)離子刻蝕的方法,在Si3N4薄膜一側(cè)的中心處加工出一個720μm×720μm的正方形窗口.③ 通過濕法刻蝕技術(shù),在硅基底上刻蝕出一個160μm×160μm的深槽,且刻蝕到Si3N4薄膜時停止.此時,該刻蝕部分薄膜下硅基底已被完全腐蝕,薄膜處于懸空狀態(tài).④ 在膜的中心區(qū)域1μm×1μm正方形內(nèi),利用離子束刻蝕技術(shù)將薄膜減薄至10nm左右.⑤ 在減薄區(qū)域采用離子束刻蝕技術(shù)加工出一個直徑約30nm的納米孔.

為了減弱實驗過程中電介質(zhì)產(chǎn)生的干擾噪聲,將納米孔芯片浸泡在125 ℃的食人魚溶液(V(H2SO4)∶V(H2O2)=3∶1)中30min,并用去離子水清洗3遍;然后,以高純氮氣吹干表面水漬,同時在孔口附近涂上一層薄PDMS[7].

1.2實驗原理與方法

實驗原理示意圖如圖1所示．納米孔將導(dǎo)電的電解質(zhì)溶液分成2個區(qū)域.通過施加外電場,產(chǎn)生通過納米孔的基準(zhǔn)離子電流.當(dāng)生物分子通過納米孔時,離子電流被部分阻塞,根據(jù)離子電流的波動便可分析生物分子的信息.在本實驗中,被檢測的生物分子為λDNA,它是一種長度為48.5kbp的雙鏈DNA,直徑為2.2nm,等電位為3.5～4.0．當(dāng)溶液pH=8.0時,DNA表面帶負(fù)電.因此,施加相應(yīng)電場時,DNA在電場力的驅(qū)動下可以通過納米孔.

(a) 電壓驅(qū)動DNA過孔

(b) 氮化硅納米孔電鏡圖圖1　DNA過孔實驗原理示意圖

實驗在pH=8.0的LiCl溶液中進(jìn)行,實驗裝置示意圖如圖2所示.首先,在2個液池中加入LiCl溶液.為了使2個液池間的離子運動只發(fā)生在納米孔內(nèi),將孔的兩端墊上橡膠墊圈密封,并將其與液池組裝在一起,使各孔中心在一條直線上, 從而保證其密封性. 將λDNA(購于Takara公司) 添加在液池的cis端,2個Ag/AgCl電極插入液池中,并連接到HEKA膜片鉗放大器(HEKAEPC10)上,以100kHz采樣頻率、10kHz低通道濾波頻率來檢

圖2　過孔實驗裝置示意圖

測離子電流.為屏蔽外來電噪聲的影響,實驗在法拉第籠中進(jìn)行.

2　實驗結(jié)果和分析

2.1阻塞離子電流信號幅值

DNA過孔時的阻塞離子電流大小主要由DNA占位體積決定,但壁面電荷、DNA帶電量、溶液濃度梯度等也會對其產(chǎn)生影響[8-10].下面研究LiCl溶液濃度為1.0,0.5,0.1mol/L時DNA過孔導(dǎo)致的阻塞離子電流信號幅值變化.

如圖3(a)所示,當(dāng)施加電壓V0=1 000mV時,不同LiCl溶液濃度下DNA過孔所造成的阻塞離子電流信號幅值接近,峰值均為650pA左右,從事件百分比上看，無法區(qū)分不同濃度的LiCl溶液中DNA過孔情況,而利用相對阻塞離子電流信號則不僅可進(jìn)行有效區(qū)分,還能反映出不同濃度對DNA過孔情況的影響.

(a) 阻塞離子電流信號

(b) 相對阻塞離子電流信號圖3　不同濃度下DNA過孔幅值比較

根據(jù)孔內(nèi)離子電流計算公式[11-12],可以推導(dǎo)出相對阻塞離子電流信號與DNA占位體積的關(guān)系,即

I0=GΔV

(1)

(2)

ΔI=ΔGΔV

(3)

ΔI=-[I0Λ/(HeffA)][1+f(dm/Dp,lm/Heff)]≈

-I0Λ/(HeffA)

(4)

式中,I0為基準(zhǔn)離子電流;ΔI為阻塞離子電流;ΔV為施加的電壓;G為孔的電導(dǎo);σ為溶液電導(dǎo)率,在1.0mol/LLiCl溶液中σ=8.98S/m;l為氮化硅納米孔膜厚,此處l=10nm;ΔG為電導(dǎo)的變化量;Λ為DNA在孔內(nèi)的占位有效體積;Heff為納米孔膜的厚度;A為孔口面積;HeffA為納米孔體積;dm為分子直徑；Dp為納米孔直徑；lm為分子長度；為了簡化計算,一般取 f(dm/Dp,lm/Heff)=0.

由式(3)和(4)可知,阻塞離子電流ΔI的變化量與電導(dǎo)ΔG的變化量、DNA在孔內(nèi)的占位有效體積Λ呈線性相關(guān).因此,可將ΔI/I0等價于ΔG/G[12].由圖3(b)和表1可以看出,當(dāng)LiCl濃度為1.0,0.5,0.1mol/L時,由DNA過孔所引起的相對阻塞離子電流信號比值ΔI/I0=0.002 79,0.005 08,0.014 42,即隨LiCl溶液濃度的下降,ΔG/G呈現(xiàn)上升趨勢.

當(dāng)納米孔中充滿電解質(zhì)溶液時,孔壁和DNA表面會呈現(xiàn)帶電性質(zhì),在本文實驗中這兩者都帶負(fù)電荷.帶電表面在溶液中會存在電性相反的離子聚集現(xiàn)象,從而形成雙電層[9].雙電層的厚度可用Debye長度κ-1來描述,而Debye長度與溶液濃度c的關(guān)系為

(5)

式中,ξ0為電常數(shù);ξr相對靜電介質(zhì)常數(shù);KB為波爾茲曼常數(shù);T為室內(nèi)溫度;e為元電荷量.

2.2過孔時間

一般來說,長鏈DNA在電場作用下以線性而非團(tuán)聚的方式穿過納米孔[13].采用納米孔檢測DNA上堿基的序列,在理論上是可行的.但是,對于目前大多數(shù)DNA檢測實驗而言,DNA的過孔速度太快,過孔時間太短,無法達(dá)到檢測單堿基的精度要求.因此,對于DNA過孔時間的研究十分必要.

當(dāng)施加電壓為1 000mV、LiCl溶液濃度為0.1,0.5,1.0mol/L時，DNA的過孔時間見圖4(a).由圖可知,當(dāng)溶液濃度從0.1mol/L增加到1.0mol/L時,DNA的過孔時間峰值由0.36ms增加到1.87ms,說明隨著LiCl溶液濃度的增加,DNA的過孔時間增大,過孔速度降低.

(a) LiCl溶液

(b) 不同溶液中的DNA過孔時間分布

(c) 不同溶液中的DNA過孔時間峰值圖4　DNA過孔時間分析

在溶液中,DNA的過孔速度與溶液黏度、環(huán)境溫度、離子濃度、溶液pH值等因素有關(guān)[14-15].改變?nèi)芤簼舛?會影響吸附在DNA表面的正離子數(shù)量[6].當(dāng)pH=8.0時,DNA表面帶負(fù)電荷,LiCl溶液濃度增加,則DNA表面吸附的Li+離子數(shù)增加,從而導(dǎo)致DNA的有效凈電荷減少.因此,當(dāng)DNA在電場力驅(qū)動下過孔時,其有效凈電荷下降,驅(qū)動力減小,進(jìn)而導(dǎo)致過孔速度下降,過孔時間變長[6].

另外,對比1.0mol/LLiCl,NaCl,KCl溶液中DNA的過孔時間發(fā)現(xiàn)(見圖4(b)和(c)),1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔時間最長(1.87ms),1.0mol/LNaCl溶液次之(0.35ms),1.0mol/LKCl溶液最短(0.30ms),這與文獻(xiàn)[6]的結(jié)論一致.LiCl溶液中DNA的過孔時間分別為KCl和NaCl溶液中的6.2和5.3倍．究其原因在于:這3種陽離子與DNA表面的結(jié)合強(qiáng)度不一樣,Li+與DNA結(jié)合能力最強(qiáng),Na+次之,K+最弱[6].DNA過孔時,Li+緊緊吸附在DNA表面,導(dǎo)致DNA的有效凈電荷減少,電場驅(qū)動力下降,過孔速度降低; 而K+容易脫落,DNA表面的凈電荷數(shù)增加,導(dǎo)致驅(qū)動力上升,過孔速度增加.

2.3過孔方式

本實驗中,納米孔直徑為38nm,DNA直徑約2.2nm,即納米孔的直徑明顯大于DNA的直徑.當(dāng)DNA在電場驅(qū)動下過孔時,可能會直接線性非折疊過孔或者折疊過孔,甚至2條DNA同時過孔.

1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔形態(tài)分析結(jié)果見圖5．圖5(a)中出現(xiàn)了雙Gauss峰(峰值P1=581pA,P2=819pA).根據(jù)納米孔內(nèi)DNA直徑公式[12],有

ΔG=Gp-GIN=G(d)-G(dIN)

(6)

(7)

式中,d為孔的有效直徑;dIN為DNA在孔內(nèi)時的等效孔徑.

由式(1)～(3)和式(6)～(7),可以計算出峰值P1對應(yīng)的DNA直徑d1=2.3nm,該數(shù)值接近雙鏈DNA直徑(2.2nm),說明此時DNA以直接線性非折疊線性方式過孔.而峰值P2對應(yīng)的DNA直徑d2=2.74nm,略大于雙鏈DNA直徑,可判斷為DNA折疊過孔.

由圖5(b)可知,實驗中還存在2條DNA同時過孔的情況,但是數(shù)量較少.

圖5(c)為過孔形態(tài)示意圖.圖中,過孔形態(tài)1為雙鏈DNA直接線性非折疊過孔,過孔形態(tài)2為DNA鏈折疊過孔,過孔形態(tài)3表示折疊和非折疊的DNA鏈同時過孔.如圖5(d)所示,3種過孔形態(tài)所對應(yīng)的阻塞離子電流信號幅值分別約為600,800,1 200pA.

3　結(jié)語

本文研究了DNA在不同濃度LiCl溶液中的過孔行為特征.結(jié)果表明,在高濃度Li+環(huán)境下,DNA表面雙電層對阻塞離子電流信號幅值的影響可以忽略,但是在低濃度Li+環(huán)境下時,雙電層的影響會使得相對阻塞離子電流信號幅值增大.當(dāng)LiCl溶液濃度由0.1mol/L增加到1.0mol/L時,DNA過孔時間隨之增加,這與DNA表面吸附的陽離子數(shù)量有關(guān).因此,增加LiCl溶液濃度可延長DNA的過孔時間,但會使相對阻塞離子電流信號幅值降低.另外,通過比較1.0mol/LLiCl,NaCl,KCl溶液的實驗結(jié)果后發(fā)現(xiàn),DNA的過孔時間與陽離子和DNA表面吸附強(qiáng)度有關(guān).最后,對1.0mol/LLiCl溶液中DNA的過孔方式進(jìn)行了分析,當(dāng)納米孔的直徑明顯大于DNA直徑時,DNA主要以直接線性非折疊和線性折疊2種方式通過納米孔.

(a) 雙Gauss峰值擬合的DNA阻塞離子電流信號幅值曲線

(b) 阻塞離子電流信號

(c) 過孔形態(tài)示意圖

(d) 局部放大阻塞離子電流信號圖5　1.0 mol/L LiCl溶液中DNA過孔形態(tài)分析

< class="emphasis_italic">References

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DetectionofDNAbasedonsolid-statenanoporeinLiClsolution

ShaJingjieShiHongjiaoXuBing

(JiangsuKeyLaboratoryforDesignandManufactureofMicro-NanoBiomedicalInstruments,SoutheastUniversity,Nanjing211189,China) (SchoolofMechanicalEngineering,SoutheastUniversity,Nanjing211189,China)

ThebehaviorsofDNAtranslocationthroughsolid-statenanoporesinthesolutionswithdifferentconcentrationsarestudiedbyusingtheLiClsolutionwithsmallvolumeofcationsasthebuffersolution,andthemechanismofDNAtranslocationisinvestigated.TheresultsshowthatwhentheconcentrationoftheLiClsolutionincreasesfrom0.1to1.0mol/L,therelativeionicblockagecurrentratiocausedbyDNApassingthoughporesdeclinesfrom0.014 42to0.002 79andthetimeofDNApassingthroughtheporesincreasesfrom0.30to1.87ms.Thecomparisonresultsfor1mol/LKCl,NaClandLiClsolutiondemonstratethatthedwelltimeofDNAintheLiClsolutionis6.2and5.3timesofthoseinKClandNaClsolutions,respectively,indicatingthatthedwellvelocitycanbeeffectivelyreducedbytheLiClsolution.Moreover,DNAisdriventhroughnanoporesinunfoldedandfoldedstatesintheLiClsolution.Therefore,theincreaseoftheLiClconcentrationcanprolongthedwelltimeofDNA,butreducetheamplitudeoftherelativeionicblockagecurrent.

nanopore;LiClsolution;DNA;ionicblockagecurrent;dwelltime

10.3969/j.issn.1001-0505.2016.05.014

2016-02-16.作者簡介:沙菁(1980—)，女，博士，副教授，major212@seu.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項目(51375092,51675101)、東南大學(xué)優(yōu)秀青年教師教學(xué)科研資助項目(2242015R30002).

:10.3969/j.issn.1001-0505.2016.05.014.

TH113;Q78

A

1001-0505(2016)05-0982-05