高衛(wèi)輝，向艷華，劉云，鄧桂明，林潔，林王森枝，賀瑤

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

中藥杜仲-牛膝配伍對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究

高衛(wèi)輝1，向艷華2，劉云2，鄧桂明1，林潔1，林王森枝2，賀瑤2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的探討杜仲-牛膝配伍組對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的干預(yù)作用。方法將84只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只，剩余60只造模成功后隨機(jī)分為：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿法骨化醇組）、杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組共5組各12只。給藥3個(gè)月后，檢測(cè)各組大鼠的血清E2、鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶和骨密度（the bone mineral density，BMD）。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、鈣離子、磷離子及BMD值明顯降低（P＜0.01），血清中堿性磷酸酶含量明顯增高（P＜0.05）。與模型組相比，牛膝組、杜仲-牛膝組大鼠血清中E2的含量明顯升高（P＜0.05）；杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠BMD值及血清中鈣離子、磷離子均明顯升高（P＜0.01）。杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中堿性磷酸酶含量均明顯降低（P＜0.05）；杜仲-牛膝組血堿性磷酸酶明顯低于杜仲組、牛膝組（P＜0.05）。結(jié)論杜仲-牛膝藥對(duì)抗骨質(zhì)疏松作用有增強(qiáng)趨勢(shì)，其作用可能與提高血清鈣離子、磷離子濃度，提高BMD有關(guān)。

杜仲-牛膝藥對(duì)；骨質(zhì)疏松癥；雌二醇；骨密度；去卵巢大鼠；杜仲；牛膝

〔Abstract〕Objective To investigate the interventional effect of Eucommia-Achyranthes compatibility on osteoporosis in ovariectomized rats.Methods Eighty-four rats were randomly divided into normal control group（n=12），sham-operation group（n=12），and the remaining 60 rats after the success of the modeling were randomly divided into model group，positive control group（group afar ossification alcohol），eucommia bark group，achyranthes group，eucommia-achyranthes group，12 rats in each group.After given medicine for 3 months，the serum estradiol（E2），calcium ion，phosphate ion，alkaline phosphatase and the bone mineral density（BMD）were detected.Results Compared with normal control group，the serum E2，calcium ion，phosphate ion and bone mineral density of model group were significantly lower than normal control group（P＜0.01），and the alkaline phosphatase in serum was more higher（P＜0.05）.Compared with the model group，the content of E2in achyranthes group and eucommia-achyranthes group was increased obviously（P＜0.05），the BMD and serum calcium ion，phosphate ion in eucommia bark group，achyranthes group，eucommia-achyranthes group，postive control group were increased obviously（P＜0.01），and the alkaline phosphatase in the groups were reduced significantly（P＜0.05）.The alkaline phosphatase of eucommia-achyranthes group was lower than that in eucommia bark group and achyranthes group（P＜0.05）.Conclusion The compatability of Eucommia-Achyranthes shows increasing trend in anti-osteoporosis，and its effect may be related to increasingserum calcium，phosphorus，improving BMD.

〔Keywords〕coupletmedicine of Eucommia-Achyranthes；osteoporosis；estradio；bone mineral density；ovariectomized rats；eucommia bark；Achyranthes bidentata

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥［1］（postmenopausal osteoporsis，PMOP）是由于體內(nèi)雌激素減少，致成骨作用降低，破骨作用增強(qiáng)，骨礦含量減少的一種退行性病變，一般發(fā)生在女性絕經(jīng)后10年左右，年齡在55～65歲。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、生活質(zhì)量的提高，人類(lèi)的壽命在延長(zhǎng)，社會(huì)老齡化程度也在逐步加深，大部分女性三分之一以上的壽命將在絕經(jīng)后期度過(guò)，髖部疼痛和股骨頸骨折率的增高［2-3］以及由此帶來(lái)的并發(fā)癥及巨大的醫(yī)療費(fèi)用使PMOP成為全球關(guān)注的健康問(wèn)題。西醫(yī)認(rèn)為PMOP是多因素性疾?。捍萍に氐娜狈Α⑦z傳因素、營(yíng)養(yǎng)狀況等，但普遍認(rèn)為雌激素的缺乏是其主要致病原因［4］。近年來(lái)，應(yīng)用雌激素治療PMOP已得到醫(yī)學(xué)界的普遍認(rèn)同，然而，長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素能明顯增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)［5］，其風(fēng)險(xiǎn)甚至超過(guò)受益；因此，針對(duì)西藥在治療骨質(zhì)疏松癥方面存在的問(wèn)題，從中醫(yī)角度，探索中藥在防治PMOP中的用藥優(yōu)勢(shì)顯得尤為重要。

本文采用雌性大鼠摘去卵巢形成骨質(zhì)疏松模型的造模方法模擬PMOP的病理狀態(tài)，通過(guò)檢測(cè)雌二醇（estradiol，E2）、骨密度（the bone mineral density，BMD）等指標(biāo)，觀(guān)察杜仲-牛膝作為藥對(duì)對(duì)PMOP的治療作用，為中藥防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1動(dòng)物

動(dòng)物選用雌性SD大鼠84只，SPF級(jí)，體質(zhì)量280～320 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。動(dòng)物于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心IVC籠具每組動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，室內(nèi)保持20℃～25℃，相對(duì)濕度12%，自由清潔飲水、進(jìn)食，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明，每周換水3次，換墊料2次，水料充足。

1.2藥物

杜仲購(gòu)自四川省宜賓市中宏藥業(yè)有限公司，懷牛膝購(gòu)自河南省焦作市健國(guó)懷藥有限公司，取成人臨床1日所用中藥劑量：杜仲10 g，懷牛膝15 g。用煎藥罐分別制成相應(yīng)濃度中藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩０⒎ü腔计褐貞c藥友制藥有限責(zé)任公司，規(guī)格：0.25μg/片。

1.3主要儀器和試劑

2003E1007113全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（意大利LOGOTECH公司產(chǎn)品）；CG-911型γ放射免疫計(jì)數(shù)器（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳公司）；鈣、磷試劑盒：上海明華體外診斷試劑有限公司；堿性磷酸酶試劑盒：伊利康生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：201203100 E2放免試劑盒：濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司。

2　方法

2.1動(dòng)物分組

將84只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只，剩余60只造模成功后隨機(jī)分為：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（阿法骨化醇組）、杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組各12只，共7組。

2.2PMOP造模與藥物干預(yù)

采用研究PMOP的病理發(fā)展過(guò)程的經(jīng)典模型［5-6］即通過(guò)將雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除來(lái)模擬動(dòng)物卵巢功能缺陷導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥，將3～10個(gè)月的雌性大鼠麻醉后將其卵巢切除，使其雌激素水平降低，從而造成骨吸收大于骨形成，使其骨量丟失［6］。杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組大鼠用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉后摘除兩側(cè)卵巢［7］，假手術(shù)組只摘除少量脂肪組織。手術(shù)后7 d天開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥12周，依據(jù)動(dòng)物與人體表面積表計(jì)算動(dòng)物給藥劑量，每周測(cè)量動(dòng)物體質(zhì)量各1次。正常對(duì)照組、假手術(shù)組模型組用蒸餾水灌胃，劑量為10 mL/kg。杜仲用1 g/kg，牛膝組用1.5 g/kg，杜仲-牛膝組用1 g/kg杜仲、1.5 g/kg牛膝的混煎劑（相當(dāng)于60 kg人劑量的6倍）灌胃。阿法骨化醇組用蒸餾水配制成混懸液，以0.05μg/kg劑量灌胃。

2.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

給藥結(jié)束后，全部動(dòng)物禁食不禁水12 h，腹主動(dòng)脈采血5 mL，收集至10 mL離心管內(nèi)，室溫下靜置1 h后離心去血清，標(biāo)記后于冰箱保存，進(jìn)行血清及放免指標(biāo)檢測(cè)。

2.3.1BMD測(cè)定剖去雙側(cè)側(cè)完整股骨，分離干凈上面所附著的肌肉組織，保留骨膜，標(biāo)記后于冰箱保存，取大鼠左側(cè)股骨按一定水平放置在BMD儀上，對(duì)左側(cè)離體股骨近端（即股骨頭端，主要為松質(zhì)骨）測(cè)定BMD。

2.3.2血清E2測(cè)定取大鼠血清樣品，用E2試劑盒，采用放免法測(cè)定，按免疫分析試劑盒的操作嚴(yán)格執(zhí)行。

2.3.3生化指標(biāo)檢測(cè)抽取各組實(shí)驗(yàn)大鼠靜脈血，取血清嚴(yán)格按照全自動(dòng)化生化儀進(jìn)行檢測(cè)血清鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料均以“±s”表示，先行正態(tài)性分析及方差齊性分析，滿(mǎn)足正態(tài)性者，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時(shí)選擇LSD法，方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法；不滿(mǎn)足正態(tài)性時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1對(duì)BMD的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠BMD值明顯降低（P＜0.01），假手術(shù)組大鼠BMD值則無(wú)顯著性變化（P＞0.05），提示摘除雙側(cè)卵巢可使大鼠BMD值降低；與模型組相比，杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組、陽(yáng)性對(duì)照組四組大鼠BMD值均明顯升高（P＜0.01），提示杜仲、牛膝、杜仲-牛膝合用、陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠BMD值均具有一定的良性調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)表1。

3.2對(duì)血清E2的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中E2的含量明顯降低（P＜0.01），提示摘除雙側(cè)卵巢可使大鼠血清中E2的含量降低；與模型組相比，牛膝組、杜仲-牛膝組大鼠血清中E2的含量明顯升高（P＜0.05），杜仲組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清中E2的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示牛膝或杜仲-牛膝合用對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中E2的含量具有一定的調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)表1。

3.3對(duì)血清鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中鈣離子、磷離子含量明顯降低（P＜0.01），堿性磷酸酶含量明顯增高（P＜0.05），與模型組相比，杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組、陽(yáng)性對(duì)照組四組大鼠血清中鈣離子、磷離子含量均明顯升高（P＜0.05），堿性磷酸酶含量均明顯降低（P＜0.05），提示杜仲、牛膝、杜仲-牛膝合用、陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶含量均具有一定的良性調(diào)節(jié)作用；陽(yáng)性對(duì)照組與杜仲-牛膝組相比，其大鼠血清中鈣離子、磷離子含量明顯偏高（P＜0.05），提示陽(yáng)性對(duì)照藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中鈣離子、磷離子含量的良性調(diào)節(jié)優(yōu)于杜仲-牛膝合用；與杜仲-牛膝組相比，杜仲組、牛膝組大鼠血清中堿性磷酸酶含量均明顯偏高（P＜0.05），杜仲-牛膝合用對(duì)血清中堿性磷酸酶的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于杜仲、牛膝單獨(dú)使用。見(jiàn)表1。

表1　試驗(yàn)各組對(duì)去勢(shì)大鼠血清E2、鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶和BMD的影響（±s，n=12）

表1　試驗(yàn)各組對(duì)去勢(shì)大鼠血清E2、鈣離子、磷離子、堿性磷酸酶和BMD的影響（±s，n=12）

注：與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較：ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，與杜仲-牛膝組比較：#P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型組假手術(shù)組杜仲組牛膝組杜仲-牛膝組陽(yáng)性對(duì)照組F值BMD（g/cm2）0.280±0.008 0.266±0.006** 0.282±0.006 0.272±0.006ΔΔ0.274±0.008ΔΔ0.277±0.005ΔΔ0.278±0.007ΔΔ8.122 E2（pg/mL）23.41±2.05 9.95±1.12** 22.90±1.77 11.22±0.93 11.41±1.04Δ12.10±1.12Δ10.07±1.41 219.89血鈣（mmol/L）2.32±0.14 2.16±0.13** 2.30±0.18 2.21±0.12Δ2.21±0.06Δ2.23±0.09Δ2.25±0.16Δ#11.11血磷（mmol/L）1.79±0.18 1.35±0.20** 1.81±0.20 1.70±0.18Δ1.68±0.13Δ1.75±0.12Δ1.75±0.25Δ#84.51血堿性磷酸酶（U/L）28.17±4.09 49.75±4.56* 28.08±4.36 39.50±2.94Δ#38.75±5.43Δ#31.67±4.02Δ33.75±5.64Δ33.74

4　討論

在近30年的臨床工作中發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期患者主以腎虛為要。對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松常以杜仲、牛膝補(bǔ)益肝腎強(qiáng)筋健骨，且療效明顯。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病因病機(jī)為腎精虧虛，絕經(jīng)后腎氣衰退，骨髓化生乏源，日久累及元?dú)馓澨摚摬「静∫蚴悄I虛，歷代醫(yī)家基本達(dá)成了腎虛為本的共識(shí)［8］。臨床上采用中醫(yī)辨證論治，證型可分為：肝腎虧虛型、脾腎陽(yáng)虛型、氣滯血瘀型，最常見(jiàn)的證型為肝腎虧虛型，中醫(yī)根據(jù)“腎主骨”的理論，故中醫(yī)在預(yù)防和治療本病是在辯證施治的基礎(chǔ)上多選用滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨的要藥。

杜仲、懷牛膝均有補(bǔ)腎健骨的作用。如《本草會(huì)言》：“腰膝之痛，非杜仲不除…補(bǔ)肝益腎，誠(chéng)為要藥?！薄秳e錄》認(rèn)為“牛膝益精、填骨髓，除腰脊痛。”牛膝還有活血通經(jīng)之特點(diǎn)，《醫(yī)學(xué)衷參西錄》曰：“牛膝為補(bǔ)益之品而善引氣血下注，故善治腎虛腰痛，或腿痿不能任地?！保?］現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：懷牛膝水煎液能顯著增加骨質(zhì)疏松大鼠的骨礦質(zhì)，增加有機(jī)質(zhì)的含量，提高BMD［10］。牛膝脫皮甾酮能明顯促進(jìn)原代培養(yǎng)去卵巢大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖［11］，改善BMD的降低，從而顯著改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織的生物力學(xué)特性，增加骨小梁骨量，延緩小梁變細(xì)、變稀，增加成骨的作用，從而有效地抗骨質(zhì)疏松［12］。杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓、安胎等功效。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，《神農(nóng)本草經(jīng)》：“杜仲補(bǔ)中益精氣、堅(jiān)筋骨。久服輕身耐老”?！侗静輹?huì)言》：“腰膝之痛，非杜仲不除…補(bǔ)肝益腎，誠(chéng)為要藥”，被歷代醫(yī)藥學(xué)家所重視。杜仲在中醫(yī)藥中一直被用作防治骨質(zhì)疏松癥的良藥，且具有類(lèi)雌激素樣作用，可提高去勢(shì)大鼠血清中E2含量，進(jìn)而有效地阻止大鼠去勢(shì)引起的骨丟失，并且未發(fā)現(xiàn)副作用［13］。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松的I型，都屬于退行性的骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后的婦女雌激素水平迅速減少致使骨量丟失加快、骨的微化結(jié)構(gòu)退化，使骨的脆性增加，從而導(dǎo)致全身骨骼疼痛或髖、膝蓋、碗關(guān)節(jié)疼痛［14-15］。BMD是診斷骨質(zhì)疏松癥的主要定量指標(biāo)［16］，有研究對(duì)腎虛者和非腎虛者進(jìn)行骨含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)腎虛患者的尺骨、橈骨的骨含量均顯著低于同齡的健康人，腎虛可影響鈣、磷代謝，進(jìn)而使BMD下降，發(fā)生骨質(zhì)疏松癥［17］。如若能及時(shí)干預(yù)血清鈣離子、磷離子濃度，提高BMD，則可緩解患者疼痛，控制病情的發(fā)展。大量臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究表明中藥在治療和防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松方面具有確鑿療效且副作用小，能減輕骨痛，提高鈣離子、磷離子、BMD，提高患者生活質(zhì)量［18-19］。

本研究采用切除雌性大鼠卵巢的方法造成類(lèi)似絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型，觀(guān)察陽(yáng)性對(duì)照組、杜仲組、牛膝組、杜仲-牛膝組對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用。結(jié)果顯示用藥各組BMD值、血鈣、血磷均有不同程度的升高，且杜仲-牛膝組較杜仲組、牛膝組均明顯升高。提示與杜仲、牛膝單味藥相比，杜仲-牛膝藥對(duì)改善去卵巢大鼠的BMD、血鈣、血磷作用更明顯，且與阿法骨化醇作用相當(dāng)。用藥各組堿性磷酸酶有不同程度的降低，杜仲-牛膝藥對(duì)改善去卵巢大鼠的血清堿性磷酸酶作用不明顯，弱于阿法骨化醇。杜仲-牛膝配伍可有效治療因癥雌激素下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松；療效優(yōu)于單純使用杜仲、牛膝；同時(shí)此實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了杜仲-牛膝藥對(duì)的科學(xué)合理性，為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的婦女的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯楊瑛）

Influence of TCM Eucomm ia-Achyranthes Compatibility on Osteoporosis in Ovariectom ized Rats

GAO Weihui1，XIANG Yanhua2，LIU Yun2，DENG Guiming1，LIN Jie1，Lin Wangsenzhi2，He Yao2
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.011

2015-07-10

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012FJ4287）。

高衛(wèi)輝，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床、科研、教學(xué)工作。