蔡蔚，謝海平，龍蠡，謝曉，楊華偉

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

馬歸液對腺性膀胱炎大鼠膀胱組織Bcl-2、Bax表達的影響

蔡蔚，謝海平，龍蠡，謝曉，楊華偉

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的通過觀察馬歸液對腺性膀胱炎大鼠模型膀胱組織的影響，為運用馬歸液治療腺性膀胱炎提供實驗基礎和理論依據(jù)。方法首先通過對大鼠膀胱灌注大腸埃希菌成功建立腺性膀胱炎大鼠模型，然后對造模成功的大鼠分別灌注馬歸液第1組為1次/周；馬歸液第2組為2次/周、吡柔比星、生理鹽水8周，再對各組大鼠膀胱組織進行病理學檢查、透射電鏡檢測和Bcl-2、Bax基因表達檢測，以觀察各組大鼠膀胱黏膜組織結構的變化。結果經(jīng)馬歸液灌注，馬歸液1組、馬歸液2組病理學檢查顯示膀胱組織正常無炎性病變；Bax、Bcl-2灰度均值比較，馬歸液2組、馬歸液1組的灰度均值與生理鹽水組比較，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），馬歸液2組與馬歸液1組比較，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Bcl-2/ Bax中，馬歸液1組、馬歸液2組分別與吡柔比星組、生理鹽水組組間比較中均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），馬歸液2組與馬歸液1組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論馬歸液對大鼠腺性膀胱炎膀胱黏膜有明顯治療效果，具有修復作用，且一周灌注兩次療效最佳。

腺性膀胱炎；大鼠；馬歸液；Bcl-2；Bax

〔Abstract〕Objective To observe the effect of Magui liquid on bladder tissues in rats with cystitis glandularis，and to provide the experimental basis and theoretical basis for the treatment of cystitis glandularis.Methods Firstly，the model rats with cystitis glandularis were successfully established by bladder instillation of Escherichia coli.The successful model rats were given Magui liquid（group 1：once a week；group 2：twice a week），pirarubicin and physiological saline for eight weeks.Then，the bladder tissues of rats in each group were given pathological examination and electron microscopy assay，and the Bcl-2，Bax expressions were detected.The changes of the structure of bladder mucosa in rats were detected.Results After the perfusion of Magui liquid，the pathological examination of Magui liquild groups showed that the bladder tissue had no inflammatory disease.Compared with the physiological saline group，the Bax and Bcl-2 gray mean were statistically significant（P＜0.05），the diffrences between Magui liquild groups were not statistically significant（P＞0.05）.Compared with pirarubicin and physiological saline group，the Bcl-2/Bax in Magui liquild groups was statistically significant（P＜0.05），the Bcl-2/Bax between Magui liquid groups has no statistically significant（P＞0.05）.Conclusion Magui liquild shows obvious effect and repair functioon on the glandular cystitis bladdermucosa of rats，and the rats with best curative effect are given perfusion for two times a week.

〔Keywords〕cystitis glandularis；rats；Magui liquild；Bcl-2；Bax

腺性膀胱炎是一種膀胱黏膜增生性病變，以尿頻、尿急、恥骨上方脹痛及夜尿等為主要表現(xiàn)的慢性膀胱疾患，隨著腔內(nèi)泌尿外科技術的普及，膀胱鏡檢及病理活檢技術的提高，腺性膀胱炎的檢出率明顯升高［1］，臨床資料提示腺性膀胱炎與膀胱腫瘤有一定關系，多數(shù)學者認為［2］腺性膀胱炎是潛在的癌前病變。目前治療上多采用經(jīng)尿道膀胱電灼術及化療藥膀胱灌注等措施，但對機體組織存在明顯的副作用。目前尚無有效措施從根本上解決腺性膀胱炎，因此對腺性膀胱炎及膀胱癌的防治研究顯得尤為重要。本實驗以腺性膀胱炎大鼠模型為研究對象觀察自制馬歸液對其作用機制，現(xiàn)將實驗報告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物成年雌性SD大鼠62只，體質(zhì)量（220±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗室提供。自由飲水，普食喂養(yǎng)，適應飼養(yǎng)1周。

1.1.2藥物吡柔比星藥液制備：吡柔比星凍干粉針劑30 mg，加注射用水配成50 mL溶液備用（吡柔比星，10 mg/支，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為（1505c4）。馬歸液：由馬鞭草30 g，當歸20 g，赤芍20 g，生黃芪20 g四味藥物制備而成，以上藥材由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科制劑中心提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥學教研室鑒定符合藥典規(guī)定。大腸埃希菌溶液（濃度在108～109CFU/100 uL）由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物室提供。25%烏拉坦溶液（由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供）。

1.1.3特殊藥品制作大腸埃希菌溶液的制備：在無菌條件下，從-70℃冰箱取出DH5a大腸埃希菌菌種，挑起菌種接種在裝有5 mL LB培養(yǎng)基的無菌離心試管中，置于37℃恒溫搖床，轉(zhuǎn)速150 r/min。10 h后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在108～109CFU/100μL濃度。馬歸液的制備：由馬鞭草30 g，當歸20 g，赤芍20 g，生黃芪20 g。制備工藝：將當歸冷浸0.5 h，用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器保存，藥渣與馬鞭草、赤芍、黃芪加水煎煮三次，加水量分別為藥材量的10倍、8倍、8倍，第1次2 h，第2、3次各1.5 h，合并煎液，濾過，濾液與上述水溶液合并，靜置24 h，濾過，濃縮至近50 mL，加入防腐劑適量與當歸揮發(fā)油，調(diào)整總量至50 mL，攪勻，灌封，滅菌，即得。

1.2方法

1.2.1實驗動物模型的制備

1.2.1.1腺性膀胱炎大鼠造模過程將成年雌性SD大鼠62只，完全隨機分為3組：空白組（10只）、生理鹽水灌注組（10只）和造模組（42只）；造模組：膀胱灌注DH5α大腸桿菌溶液（108-109CFU/100UL）0.2 mL，隔日1次，共20次；生理鹽水灌注組：膀胱灌注生理鹽水，隔日1次，共20次?？瞻捉M不行膀胱灌注。用25%烏拉坦按1.0 g/kg劑量腹腔注射麻醉SD大鼠，仰臥固定大鼠，常規(guī)消毒會陰部。將無菌硬膜外導管用無菌液體石蠟潤滑后，提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道1 cm左右。通過抽吸導管排除大鼠殘余尿液，分別用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL無菌生理鹽水、大腸桿菌溶液。然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。50天后每組隨機選取大鼠2只，處死取出膀胱，行H-600型透射電子顯微鏡超微病理檢測及病理學檢測，造模組大鼠膀胱黏膜固有層出現(xiàn)炎性浸潤、Brunn巢、囊腔，證實造模成功。

1.2.1.2給藥將造模成功的大鼠40只，完全隨機分成四組：生理鹽水組、馬歸液1組、馬歸液2組、吡柔比星組。生理鹽水組：每周一麻醉后膀胱灌注1次生理鹽水，持續(xù)8周；馬歸液1組：每周一麻醉后膀胱灌注一次馬歸液，持續(xù)8周；馬歸液2組：麻醉后膀胱灌注2次馬歸液，時間分別為周一、周五，持續(xù)8周；吡柔比星組：每周一麻醉后膀胱灌注1次吡柔比星注射液，持續(xù)8周。

1.2.2標本切取60 d后對全部模型大鼠用25%烏拉坦溶液進行麻醉，劑量為1.0 g/kg；然后進行斷頸處死，取仰臥位，固定四肢；剪開會陰部皮膚，提起大鼠膀胱底部，分離至尿道近端剪斷，取出膀胱。

1.2.3各組標本常規(guī)病理學檢查及免疫組化檢測觀察膀胱的大體形態(tài)，迅速用10%甲醛溶液將膀胱體部和膀胱三角固定。用10%甲醛溶液將標本定型、然后用流水沖洗，再用酒精進行脫水，使用二甲苯將標本進行兩次透明，然后標本浸蠟，用硬蠟將浸蠟后的標本包埋，并做好標記。并對包埋好的標本修切，進而連續(xù)常規(guī)切片、展片、HE染色。做好切片，分別置于100倍、200倍、400倍顯微鏡下觀察膀胱黏膜固有層是否有炎性細胞浸潤、腺體樣結構、囊腔和Brunn巢結構。免疫組化檢測bcl-2及Bax，具體操作見說明書。

1.2.4各組大鼠透射電鏡檢查取材：將膀胱標本切成組織塊約1 mm×1 mm×3 mm大小。固定：在由2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制的固定劑中進行不少于2 h的固定，再漂洗3次，漂洗劑為0.1M磷酸漂洗液，每次一刻鐘左右；再次固定1-2 h，固定劑為1%鋨酸固定液，漂洗3次，漂洗劑為0.1M磷酸漂洗液，每次一刻鐘左右。脫水：50%丙酮10-15 min，70%丙酮10～15 min，90%丙酮10-15 min，100%丙酮15～20 min，中間更換一次。浸泡、包埋：使用純丙酮+包埋液（1∶1），在37℃下進行12小時的浸泡、包埋；然后在純包埋液、37℃下，進行10-12 h的浸泡、包埋。固化：37℃烘箱內(nèi)過夜固化，然后60℃烘箱內(nèi)固化12～24 h。超薄切片機切片50-100 nm。3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色。FEI Tecnai G2 Spirit透射電鏡觀察。

1.2.5Real-time PCR實驗標本制取過程［3］引物設計從NCBI中下載以下基因序列，引物設計采用Primer 5.0軟件，引物序列見表1。Real-time PCR法檢測Bcl-2及Bax基因表達，操作過程見說明書。

表1　用于多重PCR擴增的特異性引物

2　結果

2.1病理結果

生理鹽水組：可見膀胱黏膜上皮層變薄，基底層空泡樣變，固有層排列混亂，血管增多，局部有炎性浸潤，可見腺體樣結構；馬歸液1組、馬歸液2組：上皮細胞排列正常，未見炎性浸潤；吡柔比星組：可見膀胱黏膜上皮層變厚，基底層空泡樣變，固有層排列混亂，血管增多，未見炎性浸潤。見圖1。

2.2體視學圖像分析

Bax表達中，馬歸液2組的灰度值均數(shù)明顯小于吡柔比星組，馬歸液2組灰度與吡柔比星組、生理鹽水組比較均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與馬歸液1組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；吡柔比星組的灰度均數(shù)明顯大于生理鹽水組、馬歸液1組，吡柔比星組的灰度與馬歸液1組、生理鹽水組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；馬歸液1組與生理鹽水組相比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Bcl-2表達中，灰度值均數(shù)由大到小分別為：馬歸液2組、馬歸液1組、生理鹽水組、吡柔比星組；馬歸液2組的灰度與吡柔比星組、生理鹽水組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與馬歸液1組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；馬歸液1組的灰度與生理鹽水組、吡柔比星組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），吡柔比星組的灰度與生理鹽水組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1　膀胱組織HE染色圖（×400）

表2　各實驗組的Bax、Bcl-2灰度值（±s，n=10）

表2　各實驗組的Bax、Bcl-2灰度值（±s，n=10）

注：Bax表達中，吡柔比星組、生理鹽水組比較，*P＜0.05，與馬歸液1組、生理鹽水組比較，★P＜0.05；與生理鹽水組相比較，☆P＜0.05。Bcl-2表達中，與吡柔比星組、生理鹽水組比較，□P＜0.05，與馬歸液1組比較，□P＞0.05；與生理鹽水組、吡柔比星組比較，■P＜0.05，與生理鹽水組比較，●P＜0.05。

組別生理鹽水組吡柔比星組馬歸液1組馬歸液2組Bax 86.7±22.4 94.5±25.4★75.6±22.5*★☆69.7±9.1* Bcl-2 87.5±46.0 80.5±31.0●93.3±21.9■99.6±18.3□

2.3電鏡結果

生理鹽水組：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮可見聚集的炎性細胞，并存在炎性浸潤，各細胞完整，細胞間連接稍疏松；細胞內(nèi)線粒體存在大量空泡樣變，提示線粒體大量鈣化；核仁飽滿；溶酶體增多，高爾基體可見；馬歸液1組：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮可見單個的炎性細胞，無炎性浸潤，各細胞完整，細胞間連接緊密；細胞內(nèi)線粒體存在少量空泡樣變；核仁飽滿；溶酶體減少，高爾基體可見；馬歸液2組：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮未見炎性細胞，各細胞完整，細胞間連接緊密；細胞內(nèi)線粒體存在少量空泡樣變，核仁飽滿；溶酶體數(shù)量大致正常，高爾基體可見；吡柔比星組：各大鼠膀胱黏膜及移行上皮未見炎性細胞，細胞活性降低，并出現(xiàn)細胞撕裂，細胞間連接疏松；細胞內(nèi)線粒體存在大量空泡樣變；大部分核仁飽滿，少量核仁畸形；溶酶體減少，高爾基體可見。見圖2。

圖2　膀胱組織電鏡觀察圖（×400）

2.4Real-time PCR實驗結果

如表3所示：（1）Bcl-2/β-actin中，馬歸液2組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較中有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；馬歸液1組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較中有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；馬歸液1組與馬歸液2組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）Bax/ β-actin中，吡柔比星組與其余三組比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），馬歸液1組、馬歸液2組與生理鹽水組組間比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（3）Bcl-2/Bax中，比值均數(shù)由大到小依次為：生理鹽水組、馬歸液2組、馬歸液1組、吡柔比星組；馬歸液2組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較中有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；馬歸液1組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較中有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；馬歸液1組與馬歸液2組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

如圖3所示，Bax電泳結果馬歸液2組、馬歸液1組條帶光譜密度最低，生理鹽水組條帶光譜密度有所增強，吡柔比星組條帶光譜密度最強；如圖F所示，Bcl-2電泳結果馬歸液2組、馬歸液1組、生理鹽水組條帶光譜密度無明顯差異，但均明顯強于吡柔比星組條帶光譜密度。

表3　Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin、Bcl-2/Bax各組間相對表達量（±s，n=10）

表3　Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin、Bcl-2/Bax各組間相對表達量（±s，n=10）

注：①Bcl-2/β-actin，馬歸液2組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較○P＜0.05；馬歸液1組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較♂P＜0.05；②Bax/β-actin，與吡柔比星組比較◆P＜0.05；③Bcl-2/Bax，馬歸液2組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較▼P＜0.05；馬歸液1組、吡柔比星組與生理鹽水組組間比較▽P＜0.05。

分組生理鹽水組吡柔比星組馬歸液1組馬歸液2組Bcl-2/β-actin 1.3875±0.1879○♂0.8213±0.1360○♂1.1863±0.1360 1.1438±0.1951○♂Bax/β-actin 0.8225±0.0465◆0.9825±0.1152 0.8500±0.0141◆0.8213±0.0259◆Bcl-2/Bax 1.6858±0.1941▼▽0.8332±0.0695▼▽1.3954±0.1567▽1.3986±0.2689▼

圖4　不同組別的Bcl-2電泳結果

3　討論

腺性膀胱炎是一種膀胱黏膜增殖性、化生性病變，其病因及生物學意義目前尚未完全明確，目前認為其主要原因是尿路慢性感染。而大腸埃希菌是最常見的致病菌，可黏附于尿路上皮，從而避免被尿流沖刷，感染力更強，更容易導致腺性膀胱炎的發(fā)生。并且大腸埃希菌內(nèi)毒素能誘發(fā)膀胱黏膜細胞脫落類似細胞凋亡［4］。而現(xiàn)代對腺性膀胱炎的治療多采用化療藥物膀胱灌注，但此治療方法不能減輕患者癥狀，甚至有些患者灌注后尿路刺激癥狀加重，讓很多病人難以接受或者不能堅持治療。隨著現(xiàn)代醫(yī)學對疾病的研究逐步深入，越來越多的學者對腺性膀胱炎電灼術后行膀胱灌注化療的科學性、有效性提出了質(zhì)疑，化療藥物不僅僅對炎性細胞具有殺滅作用，對正常細胞也有殺滅作用。本課題組自制馬歸液具有抗菌、抗腫瘤、消炎止痛、止血等作用，以往研究也表明了［5］其對腺性膀胱炎是具有很好的療效的。

本次實驗病理學檢驗結果再次證明馬歸液對腺性膀胱炎具有明確療效，炎性細胞消失，組織恢復正常，與正常大鼠膀胱黏膜對比，無明顯差異；而經(jīng)吡柔比星化療藥物灌注的大鼠膀胱黏膜，雖未見炎性細胞，但黏膜未見恢復；且透射電鏡結果從形態(tài)學上更加證明了這一點：馬歸液與吡柔比星均有抑制及殺滅炎性細胞的作用，但是吡柔比星對膀胱組織細胞不僅不具有修復作用而且具有殺傷作用，并出現(xiàn)細胞畸形、凋亡；而馬歸液組對膀胱組織未見損傷。

細胞凋亡是由多種相關基因和其蛋白調(diào)節(jié)，而調(diào)控細胞凋亡的關鍵分子是Bcl-2家族蛋白，其中與細胞凋亡關系最緊密的凋亡調(diào)控基因是Bcl-2、Bax［6-7］。Bcl-2是抑制凋亡基因；Bax是促凋亡基因，并具有拮抗Bcl-2抑制細胞凋亡的作用。Bcl-2和Bax的比率直接關系到細胞凋亡的進程以及對機體的影響［8］；也有研究表明［9］Bcl-2可以阻止線粒體釋放細胞色素C到細胞質(zhì)，通過抑制Caspase蛋白的水解從而達到了抑制細胞凋亡，是一種較為肯定的抗凋亡基因。而Bax蛋白是與Bcl-2相關X蛋白，是Bcl-2的顯性抑制因子，是促進細胞凋亡基因的代表，Bax和Bcl-2相互形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡，當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時則實現(xiàn)了Bcl-2抑制細胞凋亡的功能。Bax和Bcl-2成為了細胞凋亡的正負調(diào)控，兩者比例決定了細胞凋亡的走向［10］。若Bcl-2/Bax［11］比例增高，則抑制細胞凋亡。反過來，則促進細胞凋亡。

本研究表明，在吡柔比星組中Bax、Bcl-2平均灰度，與生理鹽水組相比，結果顯示，Bax的蛋白及基因的表達量明顯上升趨勢，而Bcl-2的蛋白及基因的表達量則降低；且Bcl-2/Bax的比例與生理鹽水組相比較明顯降低，說明使用吡柔比星進行膀胱灌注時，加速細胞凋亡。而在馬歸液1組、2組中Bax、Bcl-2平均灰度，結果顯示，與生理鹽水組相比，Bax的蛋白及基因的表達量明顯降低趨勢，而Bcl-2的蛋白及基因的表達量則增多；且Bcl-2/Bax的比例與生理鹽水組、吡柔比星組相比較明顯上升，說明使用馬歸液進行膀胱灌注時，細胞凋亡功能被抑制；馬歸液1組與馬歸液2組相比較，顯示馬歸液2組細胞凋亡抑制效果優(yōu)于馬歸液1組。由此可見吡柔比星化療藥物不僅對炎癥細胞具有殺滅作用，而且對正常細胞組織也有促進凋亡的作用，而馬歸液不但對炎癥細胞具有殺滅作用，還對正常細胞具有抑制凋亡的作用。

綜上所述，本次實驗成功構建腺性膀胱炎大鼠模型，為腺性膀胱炎的病因預防有一定的指導作用，同時為腺性膀胱炎的藥物治療研究提供了一種新的思路；本課題還從細胞凋亡角度，以Bcl-2/Bax為指標，研究結果顯示自制中藥馬歸液對腺性膀胱炎具有明顯的療效；與化療藥物相比，無明顯療效差異，均具有消炎作用；但其在安全性上明顯優(yōu)于化療藥物，具有抑制細胞凋亡可能性，而且具有藥理作用廣泛、組織毒性小、安全范圍大等特點，其原材料為純植物，生產(chǎn)簡單，技術要求低；其制備工藝簡單、經(jīng)濟，因而更具有臨床實用價值，值得更加深入探究。

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（本文編輯李杰）

Effect of M agui Liquid on the Expression of Bcl-2 and Bax in Bladder Tissue of Rats w ith Cystitis Glandularis

CAIWei，XIE Haiping，LONG Li，XIE Xiao，YANG Huawei
（The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2016.06.010

2015-10-16

湖南省自然科學基金項目（13JJ5029）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（15B175）。

蔡蔚，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治泌尿系疾病。