伍宏彪　福建省松溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心　353500

免疫膠體金層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用

伍宏彪福建省松溪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心353500

隨著動(dòng)物醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展創(chuàng)新，免疫膠體金層析診斷技術(shù)在不斷發(fā)展，有效提高了臨床應(yīng)用上檢出率與診斷的準(zhǔn)確性。本文通過(guò)介紹免疫膠體金層析技術(shù)的原理、構(gòu)造、分類應(yīng)用及診斷來(lái)說(shuō)明該技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

免疫膠體金層析診斷動(dòng)物疫病臨床

免疫膠體金層析技術(shù)在20世紀(jì)80年代逐漸發(fā)展起來(lái)［1］，是繼酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和放射性標(biāo)記之后又一個(gè)新的快速的抗原抗體免疫學(xué)技術(shù)。目前，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要為檢測(cè)病原［2］及針對(duì)病原在體內(nèi)產(chǎn)生的抗體［3］，或者妊娠診斷［4］等。動(dòng)物疫病的診斷與人類醫(yī)學(xué)診斷相比，往往要對(duì)較大的群體或需要到現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行診斷，因此，更需要簡(jiǎn)便快捷的診斷方法。目前免疫膠體金層析技術(shù)已成為獸醫(yī)疾病檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一。

1　膠體金免疫層析技術(shù)的原理及構(gòu)造

免疫層析技術(shù)是以抗原抗體反應(yīng)與色譜層析技術(shù)相結(jié)合的一種快速免疫分析方法。膠體金免疫層析技術(shù)通過(guò)將標(biāo)記了膠體金的抗原或抗體固定在條狀纖維素膜（membrane）上，以形成固相載體，然后將待測(cè)樣品以液體形式加入到一端的樣本墊（sample pad）之后，通過(guò)液體在硝酸纖維素膜上形成的毛細(xì)作用（capillary flow）而向前移動(dòng)，同時(shí)使待測(cè)樣品中的受測(cè)物與硝酸纖維素膜上的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合物被富集在特定區(qū)域（test line），通過(guò)膠體金的顏色反應(yīng)而得到直觀的結(jié)果，而游離的標(biāo)記物則越過(guò)檢測(cè)帶（control line）進(jìn)入到末端的吸水墊（wicking pad），不呈現(xiàn)顯色反應(yīng)。膠體金免疫層析試紙條的構(gòu)造模式見(jiàn)圖1。

2　膠體金免疫層析技術(shù)的分類及結(jié)果判斷

膠體金免疫層析按照反應(yīng)模式可以分為三類，即：間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法［5］。其中夾心法又可分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法。對(duì)未知抗原的檢測(cè)常采用雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法，而對(duì)未知抗體的檢測(cè)常采用雙抗原夾心法和間接法。

3　免疫膠體金技術(shù)在動(dòng)物疾病中的應(yīng)用

3.1傳染病的診斷

3.1.1病毒病的診斷廖圓圓等［6］建立了間接膠體金免疫層析方法用于檢測(cè)犬血清中RV IgG抗體，該方法不僅敏感性高（可檢出最低中和抗體效價(jià)水平0.5 IU/mL），且與商品ELISA檢測(cè)試劑盒的總符合率達(dá)到99.4%。陳一鳴等［7］用研制的PRRS抗體試紙條與ELISA檢測(cè)方法分別對(duì)36份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示PRRS抗體試紙條的敏感度為81.5%，特異度為100%，符合率為86.1%，重復(fù)性良好。王中力等［8］構(gòu)建了檢測(cè)犬細(xì)小病毒（CPV）的間接膠體金免疫層析法，（GICA）敏感性為100%；特異性為97.3%；與HA檢測(cè)結(jié)果符合率為98.3%，對(duì)犬重要傳染性疾?。ㄈ?xì)小病毒?。┑脑\斷提供了快速的檢測(cè)方法。因此，膠體金免疫層析診斷方法適合于臨床的快速診斷。

3.1.2細(xì)菌病的診斷劉凱等［9］構(gòu)建了牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法，該方法采用雙抗體夾心法檢測(cè)牛源巴氏桿菌，經(jīng)優(yōu)化后該方法與細(xì)菌檢查結(jié)果一致性為100%，無(wú)交叉反應(yīng)，穩(wěn)定性可以維持半年。布日額等［10］建立了檢測(cè)牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析方法，試紙條與致病性金黃色葡萄球菌分離鑒定法符合率為90.0%、與PCR試劑盒符合率為83.3%。李偉等［11］建立的炭疽桿菌芽孢膠體金層析檢測(cè)技術(shù)，胡孔新等［12］建立的快速檢測(cè)鼠疫桿菌抗原用的膠體金標(biāo)記免疫層析方法，諶志強(qiáng)等［13］建立的大腸桿菌0157∶H7膠體金免疫滲濾法等都能夠快速有效地對(duì)細(xì)菌性疾病進(jìn)行檢測(cè)和診斷。

3.1.3寄生蟲病的診斷王艷華等［14］將構(gòu)建的膠體金試紙條檢測(cè)人工感染弓形蟲GJS株速殖子的7只兔，對(duì)兔血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用弓形蟲分泌的抗原進(jìn)行IHA參照。結(jié)果顯示，試紙條在第3 d即可檢測(cè)出抗體，而IHA法則在第5 d才可檢測(cè)出抗體，且該方法對(duì)豬瘟及豬衣原體病陽(yáng)性血清均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)性。曾小軍等［15］建立了檢測(cè)血吸蟲的免疫膠體金技術(shù)，與IHA抗體檢測(cè)技術(shù)比較，檢出率分別為95.24%和100.00%；慢性血吸蟲病患者的檢出率分別為92.86%和94.64%。兩種方法對(duì)于血吸蟲的檢出效能一致，而膠體金技術(shù)對(duì)于血吸蟲的檢出效率略低于IHA方法，可能與包被所使用的蛋白及抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)相關(guān)。

3.2檢驗(yàn)檢疫檢驗(yàn)檢疫對(duì)于國(guó)家進(jìn)出口貨物，尤其是生物源物品的安全流通具有重要的作用，是關(guān)系到國(guó)家生物安全的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。然而對(duì)于進(jìn)出口關(guān)卡的樣品進(jìn)行檢測(cè)，需要快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，方能提高效率而不耽誤貨物中轉(zhuǎn)及旅客流通。動(dòng)物活體檢疫、動(dòng)物源性食品及流通過(guò)程中的監(jiān)測(cè)，對(duì)消費(fèi)者的消費(fèi)安全和身體健康具有直接或者間接的影響，同時(shí)制約了動(dòng)物防疫工作切實(shí)有效地開展。膠體金免疫層析技術(shù)可快速、有效地對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行診斷，并可給出診斷結(jié)果，對(duì)于檢驗(yàn)檢疫具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。

4　不同方法試驗(yàn)對(duì)比

4.1試驗(yàn)材料禽流感H5抗體快速檢測(cè)卡，深圳康百得生物科技有限公司生產(chǎn)；H5血凝抑制試驗(yàn)抗原與陽(yáng)性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；禽血清30份，隨機(jī)在散養(yǎng)戶中采集。

4.2試驗(yàn)數(shù)據(jù)從試驗(yàn)數(shù)據(jù)（見(jiàn)表1）可知，禽流感抗體快速檢測(cè)卡與禽流感HI和HA試驗(yàn)所得出的結(jié)果基本一致，區(qū)別在于，禽流感HI和HA試驗(yàn)可以得出準(zhǔn)確的數(shù)值，而H5抗體快速檢測(cè)卡只能定性作出陰性或陽(yáng)性結(jié)果判斷。

5　總結(jié)

免疫膠體金層析技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、無(wú)須使用儀器設(shè)備、快速出結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。動(dòng)物疾病診斷不但可幫助畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，更重要的可為消費(fèi)者提供安全放心的動(dòng)物源性食品。就動(dòng)物疾病的免疫膠體金層析技術(shù)研發(fā)而言，選擇何種反應(yīng)方式、包被抗體或抗原的選擇、檢測(cè)抗原或者不同抗原刺激的抗體出現(xiàn)順序等都需要考慮在內(nèi)。對(duì)于細(xì)菌引起的疾病，因菌種之間可能存在一定的抗原交叉性，故需要注意診斷方法的特異性。與此同時(shí)，還需要盡可能提高試紙條的敏感性，而且對(duì)于一項(xiàng)新的檢測(cè)技術(shù)，往往需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)踐檢驗(yàn)才能進(jìn)入臨床應(yīng)用和推廣。如果能很好地解決免疫膠體金層析試紙條檢測(cè)方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，而研發(fā)出一種比較成熟的檢測(cè)技術(shù)，無(wú)疑具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景，同時(shí)也應(yīng)成為廣大科技工作者努力的方向。

［1］Faulk W P，Taylor G M.Communication to the editors：an immunocolloid method for the electron microscope［J］.Immuno chemistry，1971，8（11）：1081-1083.

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［3］李云，焦春梅.膠體金免疫層析法檢測(cè)梅毒螺旋體特異性抗體的方法學(xué)評(píng)價(jià)［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2002，9（6）：411.

［4］Beggs M，Novootney M，Sampetro S，et al.A self performing chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadorophin（HCG）in rurine and serum［J］.Clin Chem，1990，36：1084-1085.

［5］任娟.膠體金免疫層析技術(shù)研究現(xiàn)狀及進(jìn)展［J］.新疆畜牧業(yè)，2011（12）：22-24.

［6］廖園園，錢金宏，唐利軍，等.檢測(cè)犬抗狂犬病毒抗體的膠體金免疫層析法的建立及應(yīng)用［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（9）：705-708.

［7］陳一鳴.豬繁殖與呼吸綜合征抗體免疫膠體金快速診斷試紙的研制［D］.成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［8］王中力，宋曉暉，陳西召，等.犬細(xì)小病毒病免疫膠體金診斷技術(shù)的研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（1）：62-66.

［9］劉凱，劉忠清，李德文.牛出血性敗血癥膠體金免疫層析快速診斷方法［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（11）：134-136.

表1　不同方法檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

［10］布日額，任曉峰，吳金花，等.牛乳中致病性金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)膠體金免疫層析方法研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（11）：907-911.

［11］李偉，王靜，胡孔新，等.應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立炭疽桿菌芽孢的快速檢測(cè)方法［J］.中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2004，27（6）：329-331.

［12］胡孔新，李偉，姚李四，等.建立快速檢測(cè)鼠疫耶爾森菌的膠體金免疫層析法［J］.中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2004，27（6）：332-335.

［13］諶志強(qiáng)，侯楠楠，王新為，等.大腸埃希菌O157：H7的金增強(qiáng)膠體金免疫滲濾檢測(cè)法［J］.環(huán)境與健康雜志，2011，28（2）：105-108.

［14］王艷華，李克生，才學(xué)鵬，等.弓形蟲抗體免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（1）：29-32.

［15］曾小軍，陳紅根，袁建華，等.快速膠體金免疫層析法的建立及其對(duì)血吸蟲病的診斷效果［J］.中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2005，17（1）：24-27.

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