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        液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析流感病毒感染引起宿主蛋白類(lèi)泛素化修飾

        2016-10-21 11:12:42彭其勝李光譜孫萬(wàn)春楊靜波全桂花
        分析化學(xué) 2016年6期
        關(guān)鍵詞:泛素流感病毒宿主

        彭其勝 李光譜 孫萬(wàn)春 楊靜波 全桂花 劉 寧

        摘要干擾素刺激基因15編碼蛋白質(zhì)(Interferon stimulated gene 15 kDa protein, ISG15)是最早被鑒定的類(lèi)泛素分子蛋白質(zhì),在病毒感染和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。本研究利用免疫沉淀技術(shù)將被類(lèi)泛素ISG15修飾的蛋白富集純化,采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)流感病毒感染A549宿主細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生的類(lèi)泛素ISG15修飾蛋白進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在流感病毒感染的實(shí)驗(yàn)組A549細(xì)胞中,鑒定到了22種來(lái)源于宿主細(xì)胞的ISG15修飾的蛋白,包括類(lèi)泛素蛋白ISG15、細(xì)胞周期蛋白T1、熱休克蛋白71、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白、真核翻譯起始因子等,以及1種來(lái)源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。在鑒定的22種宿主蛋白中,有6種蛋白在未感染病毒的對(duì)照組A549細(xì)胞中也得到鑒定,包括膜聯(lián)蛋白A1、果糖二磷酸醛縮酶A、線粒體三磷酸腺苷合成酶亞基g、烯醇化酶、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白。生物信息學(xué)分析表明,流感病毒感染引起的ISG15修飾的宿主蛋白分別歸屬于9個(gè)不同的蛋白分類(lèi),包括細(xì)胞骨架蛋白、分子伴侶蛋白、酶調(diào)節(jié)劑、核酸結(jié)合蛋白、激酶類(lèi)、轉(zhuǎn)移酶類(lèi)、轉(zhuǎn)錄因子、氧化還原酶類(lèi)以及結(jié)構(gòu)蛋白。本研究為大規(guī)模分析鑒定ISG15修飾蛋白提供了一種特異、有效的研究方法。

        關(guān)鍵詞 流感病毒; 類(lèi)泛素蛋白; 干擾素刺激基因15編碼蛋白質(zhì); 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

        1引言

        流感病毒等微生物在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制和拮抗宿主免疫反應(yīng)涉及到細(xì)胞內(nèi)的多種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如WNT[1], NFКB[2], MAPK[3], PI3K/Akt[4]等,是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在此過(guò)程中,蛋白質(zhì)翻譯后修飾如泛素和類(lèi)泛素化修飾起到了十分重要的作用。泛素和類(lèi)泛素化修飾是一類(lèi)最富誘導(dǎo)性和可逆性的蛋白修飾[5]。其中,干擾素刺激基因15蛋白 (Interferon stimulated gene 15 kDa protein,ISG15) 類(lèi)泛素化修飾在調(diào)節(jié)病原微生物的感染和復(fù)制、宿主細(xì)胞先天免疫反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[6,7]。ISG15是由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種分子量約為15 kDa的蛋白質(zhì),由兩個(gè)泛素樣的小亞基通過(guò)一個(gè)短鉸鏈區(qū)連接組成[8]。ISG15對(duì)蛋白質(zhì)的修飾作用是可逆的共價(jià)修飾,可以調(diào)節(jié)底物蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等[9]。研究表明,ISG15缺失的小鼠對(duì)包括流感病毒在內(nèi)的許多病毒感染的易受性明顯高于野生型小鼠[10]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),ISG15修飾能夠在很大程度上抑制流感病毒在人源細(xì)胞中的基因表達(dá)和復(fù)制,而在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中卻沒(méi)有觀察到明顯的類(lèi)似的抑制作用[11]。這說(shuō)明,類(lèi)泛素修飾ISG15在流感病毒感染人源細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此,分析鑒定流感病毒感染引起人源宿主細(xì)胞中類(lèi)泛素ISG15修飾蛋白的變化,對(duì)于深入理解人源宿主通過(guò)ISG15抵抗病毒感染的分子機(jī)制具有重要意義。

        現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和大規(guī)模蛋白質(zhì)組分析等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。相對(duì)于其它分析技術(shù),質(zhì)譜技術(shù)具有高分辨率和高靈敏度等優(yōu)勢(shì),逐漸成為多肽、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析研究中最為重要的技術(shù)手段之一[12~15]。而免疫沉淀技術(shù)是基于高特異性的抗體抗原反應(yīng),利用抗體將復(fù)雜混合物中的抗原分子特異性富集的一種樣品制備技術(shù)。目前,將免疫分離技術(shù)與質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合,已經(jīng)成為對(duì)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行定性、半定量、甚至定量分析的強(qiáng)有力手段。這種分析技術(shù)將傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)的高度特異性和質(zhì)譜技術(shù)的高度靈敏性、高分辨率等特性相結(jié)合,可以對(duì)復(fù)雜生物樣品如具有各種翻譯后修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定[16,17]。

        目前,大規(guī)模分析泛素或類(lèi)泛素修飾的研究主要集中于對(duì)泛素(Ubiquitin)和類(lèi)泛素(SUMO、ISG15)修飾蛋白在各種生物學(xué)體系中的表征[18~21]。對(duì)于流感病毒感染人源宿主細(xì)胞過(guò)程中ISG15修飾蛋白的大規(guī)模分析研究未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。在本研究中,采用免疫沉淀技術(shù)與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),對(duì)流感病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的ISG15修飾蛋白進(jìn)行分析鑒定。首先將人流感病毒株H3N2接種到來(lái)源于人肺腺癌上皮的細(xì)胞系A(chǔ)549中,感染一定時(shí)間后,利用免疫沉淀技術(shù)將被類(lèi)泛素ISG15修飾的蛋白富集純化,利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)富集蛋白進(jìn)行分析,成功鑒定到了22種來(lái)源于宿主細(xì)胞的蛋白(包括類(lèi)泛素ISG15蛋白)和1種流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)果表明,流感病毒感染能夠引起多種宿主蛋白的類(lèi)泛素ISG15修飾,而免疫沉淀結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以非常有效地對(duì)類(lèi)泛素ISG15修飾蛋白進(jìn)行分析鑒定。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        LTQ Orbitrap電場(chǎng)軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司);BIO Wide Pore C18 反相毛細(xì)管色譜柱(150 mm×0.18 mm, 5 μm, 美國(guó)Sigma公司);MiniPROTEAN Tetra Cell垂直電泳及Mini TransBlot Cell電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國(guó)BioRad公司);Allegra TM X22R離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);Microchemi Chemiluminescence system 4.2凝膠成像儀(以色列DNR BioImaging Systems公司);Varioskan Flash酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司);四維旋轉(zhuǎn)混合儀(海門(mén)其林貝爾公司)。

        Bradford蛋白定量試劑盒、尿素、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺(美國(guó)BioRad公司);測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司);免疫沉淀試劑盒Classic IP Kit(美國(guó)Pierce公司);甲酸、乙腈、β巰基乙醇(美國(guó)Sigma公司);抗ISG15單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗(美國(guó)Santa Cruz公司);DMEM培養(yǎng)基美國(guó)(Hyclone公司);胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);牛血清白蛋白(BSA)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司);增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL Prime,瑞典GE Healthcare公司);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。人肺腺癌上皮的細(xì)胞系A(chǔ)549及人流感病毒株H3N2由本實(shí)驗(yàn)室保存;實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)MilliQ純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。

        2.2病毒接種與感染A549細(xì)胞

        用含血清的DMEM培養(yǎng)基將A549細(xì)胞培養(yǎng)至80%~90%成片狀態(tài),棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗3遍。 加入含0.2%胰酶的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,接種經(jīng)適當(dāng)稀釋的流感病毒株H3N2。感染24 h后,棄去培養(yǎng)上清液,收集細(xì)胞。使用IP裂解液(pH 7.4, 25 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1% NP40, 5% Glycerol)裂解細(xì)胞,于4℃、12000 r/min離心20 min,取上清液,分裝后置

        Symbolm@@ 80℃保存。使用Bradford蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

        2.3免疫沉淀技術(shù)富集ISG15修飾蛋白

        采用Pierce公司Classic IP Kit免疫沉淀試劑盒進(jìn)行蛋白的富集。首先,在細(xì)胞裂解液上清液中加入未偶聯(lián)抗體的瓊脂糖微球(表面包被有蛋白A/蛋白G)進(jìn)行預(yù)處理,4℃旋轉(zhuǎn)振搖過(guò)夜,離心,收集上清液。再按照免疫沉淀試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟,將抗ISG15單克隆抗體偶聯(lián)到瓊脂糖磁珠表面上。經(jīng)充分清洗后,加入到經(jīng)過(guò)預(yù)處理的細(xì)胞裂解液中?;靹蚝螅?℃旋轉(zhuǎn)振搖過(guò)夜,離心收集瓊脂糖微球。經(jīng)洗滌后,用洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。對(duì)照組使用未經(jīng)流感病毒感染的A549細(xì)胞,采用相同的方法富集內(nèi)源性的ISG15修飾蛋白。將含有經(jīng)免疫沉淀富集的ISG15修飾蛋白樣品分裝后保存于Symbolm@@ 80℃。取少量蛋白樣品加入2×SDS上樣緩沖液,95℃保溫5 min。用12% SDSPAGE進(jìn)行分離,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜清洗、用BSA封閉后,與抗ISG15單克隆抗體在室溫孵育2 h。將膜充分清洗后,再與HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗在室溫孵育2 h。將PVDF膜充分清洗后,加上新混合的ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光)底物,使用凝膠成像儀記錄蛋白印跡信號(hào)。

        2.4蛋白質(zhì)樣品的胰蛋白酶水解

        在2.3小節(jié)中免疫沉淀富集的蛋白質(zhì)樣品中加入5倍體積的預(yù)冷丙酮,

        Symbolm@@ 20℃放置過(guò)夜后離心,棄去上清液。將沉淀用含有50 mmol/L NH4HCO3的2 mol/L尿素溶液溶解,加入終濃度50 mmol/L 二硫蘇糖醇溶液, 室溫放置60 min。再加入終濃度100 mmol/L 碘乙酰胺,避光反應(yīng)60 min,將巰基烷基化。加入新配制的測(cè)序級(jí)TPCK胰蛋白酶溶液,37℃反應(yīng)過(guò)夜后,加入適量10%甲酸終止反應(yīng)。離心取上清液,凍干后于

        Symbolm@@ 20℃保存。

        2.5液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析鑒定蛋白質(zhì)

        使用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析胰酶水解多肽樣品。將多肽樣品溶解在洗脫緩沖液A(99% 水+1%乙腈+0.1%甲酸)中, 經(jīng)BIO Wide Pore C18 反相毛細(xì)管色譜柱(150 mm×0.18 mm, 5 μm)分離。梯度洗脫程序?yàn)椋?0~180 min,5%~40% 緩沖液B(99% 乙腈+1% 水+0.1% 甲酸)。流速為0.25 μL/min。洗脫出的多肽直接進(jìn)入LTQ Orbitrap質(zhì)譜離子源進(jìn)行分析。毛細(xì)管溫度200℃,噴霧電壓為1.5 kV,質(zhì)核比檢測(cè)范圍為400~2000 amu。應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,每個(gè)全掃描后進(jìn)行5個(gè)二級(jí)掃描,碰撞能量為35%歸一化能量,母離子窗口寬度為2 Da,持續(xù)動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為1 min。將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理工作站,并使用Thermo Proteome Discoverer 1.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索時(shí)采用SEQUEST模式,在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。

        2.6生物信息學(xué)分析

        參照文獻(xiàn)[22,23]的方法,使用PANTHER (Protein annotation through evolutionary relationship)分析軟件對(duì)得到的ISG15修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,將所鑒定的蛋白按照不同的生物學(xué)功能進(jìn)行分類(lèi)。

        3結(jié)果與討論

        3.1ISG15修飾蛋白的免疫沉淀富集

        將H3N2病毒株接種于A549細(xì)胞,在不含血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)液,以PBS緩沖液洗滌3次后,收集并裂解細(xì)胞。對(duì)照組為未接種病毒的A549細(xì)胞,培養(yǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組相同。共進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞裂解液分別采用抗ISG15抗體免疫沉淀富集、SDSPAGE電泳分離及轉(zhuǎn)膜,進(jìn)行蛋白印跡分析(圖1)。為了減少非特異性吸附,在免疫沉淀富集之前,向細(xì)胞裂解液中加入未偶聯(lián)抗體的瓊脂糖微球進(jìn)行預(yù)吸附,然后離心棄去瓊脂糖微球。再在上清液中加入偶聯(lián)ISG15抗體的瓊脂糖微球進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,未經(jīng)病毒感染的A549細(xì)胞中也能檢測(cè)到極微量的ISG15以及ISG15修飾蛋白;而病毒感染細(xì)胞后,顯著誘導(dǎo)了ISG15及其修飾系統(tǒng)的表達(dá),使得宿主細(xì)胞蛋白產(chǎn)生明顯的ISG15修飾,說(shuō)明ISG15修飾在宿主細(xì)胞抵抗病毒的固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

        3.2ISG15修飾蛋白的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析鑒定

        將經(jīng)免疫沉淀富集的ISG15修飾蛋白進(jìn)行二硫鍵還原、碘乙酰胺烷基化后,利用胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行特異性水解,得到酶解多肽的混合物。經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析得到酶解多肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù),再通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,在流感病毒感染的A549細(xì)胞中鑒定得到包括ISG15蛋白在內(nèi)的23種蛋白(表1)。其中6種蛋白在未經(jīng)感染的細(xì)胞中也得到表達(dá),說(shuō)明在細(xì)胞正常的代謝過(guò)程中,一部分細(xì)胞內(nèi)源性蛋白也會(huì)發(fā)生ISG15修飾。文獻(xiàn)[24]表明,細(xì)胞經(jīng)過(guò)病毒感染等外界刺激后,會(huì)顯著誘導(dǎo)表達(dá)ISG15。而ISG15對(duì)感染病毒的宿主細(xì)胞中的哪些蛋白進(jìn)行修飾,尚未有系統(tǒng)的研究報(bào)道。流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是人源宿主細(xì)胞中類(lèi)泛素ISG15修飾的一個(gè)重要靶蛋白[25,26],宿主細(xì)胞通過(guò)ISG15修飾抑制NS1的功能,從而抵抗病毒在機(jī)體內(nèi)的有效復(fù)制,是病毒和宿主相互作用途徑之一。在本研究中,也同樣鑒定到來(lái)自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1。在流感病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中,NS1蛋白是一個(gè)關(guān)鍵致病因子,它通過(guò)多種機(jī)制,包括雙鏈RNA的結(jié)合和隔離來(lái)拮抗宿主的抗病毒反應(yīng)。

        目前,采用免疫沉淀和免疫共沉淀技術(shù)將目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化,再經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析鑒定的方法,已廣泛應(yīng)用于生命分析科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域 [27,28]。然而,采用這種技術(shù)對(duì)ISG15修飾蛋白的研究還鮮有報(bào)道。目前,關(guān)于ISG15修飾蛋白的研究,多先構(gòu)建帶有某種標(biāo)簽(如Flag, HA等)的ISG15表達(dá)載體,再轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。將細(xì)胞裂解后,利用對(duì)標(biāo)簽具有特異性的固相支持物對(duì)ISG15修飾的蛋白進(jìn)行富集[29,30]。這種方法對(duì)修飾蛋白富集的特異性較高(源自于標(biāo)簽的特異性)。然而由于方法本身的限制,多用于體外研究。而本研究所采用的直接對(duì)ISG15免疫富集的方法,可以更有效地分析識(shí)別內(nèi)源性ISG15的修飾狀態(tài),以及減少外源表達(dá)體系對(duì)生物學(xué)過(guò)程的干擾。因此,這種方法更適合體內(nèi)研究體系以及基于臨床樣本的研究。

        3.3ISG15修飾蛋白的生物信息學(xué)分析

        本研究得到的大部分ISG15修飾蛋白是經(jīng)病毒感染后誘導(dǎo)產(chǎn)生ISG15修飾的,這些蛋白的修飾往往跟流感病毒與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制密切相關(guān)。采用PANTHER軟件對(duì)這些蛋白(只在流感病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到的ISG15修飾的宿主蛋白,共15種)進(jìn)行了聚類(lèi)分析,將具有相似生物學(xué)功能屬性的蛋白進(jìn)行歸屬(表2)。結(jié)果表明,流感病毒感染引起的ISG15修飾蛋白具有較廣泛的功能分布,分別歸屬于9個(gè)不同的蛋白分類(lèi)(Protein class),包括細(xì)胞骨架、分子伴侶、酶調(diào)節(jié)劑、核酸結(jié)合、激酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)錄因子、氧化還原酶以及結(jié)構(gòu)蛋白。ISG15修飾作為一種重要的翻譯后修飾,在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有十分重要的作用。研究表明,ISG15可以通過(guò)多種方式在流感病毒和宿主相互作用中發(fā)揮生物學(xué)功能。一方面,ISG15可以通過(guò)對(duì)宿主蛋白的修飾,增強(qiáng)宿主對(duì)病毒的抵抗作用。另一方面,ISG15可以對(duì)病毒蛋白進(jìn)行修飾,導(dǎo)致其不能形成特定的高級(jí)結(jié)構(gòu),從而降低其對(duì)宿主抗病毒作用的抵抗能力。

        [KH*4D][HT5”SS][HJ*4]表2免疫沉淀富集的ISG15修飾蛋白的聚類(lèi)分析

        Table 2Classification of ISG15modified proteins enriched by immunoprecipitation

        [HT6SS][BG(][BHDFG4,WK8,WK18,WK8*2,WK22W]序號(hào)No.蛋白分類(lèi)Protein class基因數(shù)Gene number基因名稱Gene name

        1分子伴侶 Chaperone3TCP1, HSPA8, HSPB1

        2氧化還原酶 Oxidoreductase

        2PRDX1, ALDH18A13酶調(diào)節(jié)劑 Enzyme modulator1CCNT14

        轉(zhuǎn)移酶 Transferase1ALDH18A15核酸結(jié)合 Nucleic acid binding 6DDX39B, IF2B, SF3A1, SF3B1, STAT1, CCNT1

        6轉(zhuǎn)錄因子 Transcription factor 2STAT1,CCNT17激酶 Kinase 1ALDH18A1

        8細(xì)胞骨架 Cytoskeletal protein 2LMNB1,CALD19結(jié)構(gòu)蛋白 Structural protein 1LMNB1[BHDFG1*2,WKZQ0W][BG)W][HT5][HJ]

        4結(jié) 論

        本研究利用免疫沉淀技術(shù)將類(lèi)泛素ISG15修飾的蛋白富集純化后,利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)流感病毒感染A549宿主細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生的類(lèi)泛素ISG15修飾蛋白進(jìn)行了分析鑒定。成功鑒定出了包括ISG15在內(nèi)的22種來(lái)源于宿主細(xì)胞的蛋白和1種來(lái)源于流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。研究結(jié)果提示類(lèi)泛素ISG15在流感病毒和宿主的相互作用中發(fā)揮重要作用。本研究為大規(guī)模分析鑒定ISG15修飾蛋白提供了一種特異、有效的研究方法。

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