余定天 李文卿 黃小君 王玉霞 柯玉琴

摘 要 試驗(yàn)以烤煙中抗青枯病品種K326、感病品種CB-1號(hào)和高感品種紅花大金元（以下簡(jiǎn)稱(chēng)紅大）為材料，通過(guò)田間栽培接種青枯菌，并檢測(cè)感染后烤煙葉片抗氧化酶系統(tǒng)若干生理指標(biāo)的變化，結(jié)果表明：感染青枯菌后，中抗品種K326葉片膜透性、丙二醛（MDA）以及過(guò)氧化氫（H2O2）含量變化不顯著，而感病品種CB-1號(hào)及高感品種紅大則極顯著增加，紅大品種增加幅度大于CB-1號(hào)品種；K326品種感染青枯菌后，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著的增強(qiáng)，超氧物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性沒(méi)有明顯變化；相比之下，CB-1號(hào)及紅大品種的CAT活性顯著下降，SOD和POD活性顯著增加，紅大變幅大于CB-1號(hào)。試驗(yàn)結(jié)果闡明了不同烤煙品種對(duì)青枯菌生理反應(yīng)不同，這些指標(biāo)可以作為烤煙抗青枯病品種選育的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 烤煙品種；青枯菌感染；抗氧化效應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.18.102

煙草青枯病是一種典型維管束病害，煙草發(fā)病后很快枯萎，枯萎時(shí)葉片仍保持灰綠色[1]。由于青枯病難以防治，雖然輪作可起到一定防治作用，但受到耕地面積限制，因此培育和應(yīng)用抗性品種是防治青枯病最有效的途徑[2]。已有文章報(bào)道[2，3]K326品種表現(xiàn)出較為抗病特征，CB-1號(hào)品種表現(xiàn)出感病，而紅大表現(xiàn)出高感病特征。雖然對(duì)于煙草抗病、感病品種體內(nèi)的酶活性變化的研究已有一些報(bào)道[4，5]，但對(duì)于抗氧化酶活性與煙草品種抗性關(guān)系仍沒(méi)較系統(tǒng)的報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)3個(gè)烤煙品種接種青枯菌后抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)的檢測(cè)，比較不同抗性品種之間的生理差異，為烤煙品種青枯病抗性鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選擇具有代表性的3個(gè)不同基因型烤煙品種：對(duì)青枯病中抗品種K326、感病品種CB-1號(hào)、高感品種紅花大金元。3個(gè)品種均來(lái)源于福建省煙草專(zhuān)賣(mài)局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。

1.2 供試菌株

取病組織用稀釋分離法在TZC平板上劃線，挑取致病性單菌落，移到PSA斜面上繁殖24 h，加無(wú)菌水懸浮，在無(wú)菌條件下置于裝有肉汁胨液的三角瓶中振蕩培養(yǎng)48 h后，配成常用濃度為108 cfu/L的懸浮液，備用 。

1.3 田間栽培接菌處理

煙苗于7片葉齡移栽大田，培養(yǎng)期間按正常肥水管理，待煙株旺長(zhǎng)初期采用切根灌菌接種法，每株煙株灌菌30 mL，同時(shí)另設(shè)切根灌水30 mL作為對(duì)照，接菌感染2周后測(cè)定各品種各處理功能葉片的光合速率及相關(guān)參數(shù)，并取葉片分析以下各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定方法

細(xì)胞膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)率儀法，參照鄒琦方法[6]，用細(xì)胞膜相對(duì)透性%、傷害率%來(lái)表示對(duì)質(zhì)膜的傷害程度；MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，參照林植芳等方法[7]；SOD活性測(cè)定參照朱廣廉方法[8]。以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)SOD活性單位；POD活性測(cè)定參照李合生[9]和華東師范大學(xué)生物系植物生理教研組[10]的方法并略有改進(jìn)。以每分鐘每毫克蛋白OD值變化0.01為一個(gè)酶活性單位；CAT活性測(cè)定參照章駿德等方法[11]略加修改，以每分鐘每毫克蛋白分解H2O2 毫克數(shù)表示酶活性；H2O2含量測(cè)定采用林植芳等方法[7]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel軟件和DPS v7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以上生理指標(biāo)均重復(fù)測(cè)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 青枯菌感染對(duì)不同烤煙品種葉片細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜是活細(xì)胞與環(huán)境之間的界面和屏障，在受到病菌侵染脅迫下，膜的功能受損或結(jié)構(gòu)破壞，使其透性增加，細(xì)胞膜透性大小能夠反映出細(xì)胞質(zhì)膜受害的程度。從表1可以看出，中抗品種K326煙株接菌后膜相對(duì)透性幾乎沒(méi)變化，沒(méi)受到傷害；而感病品種CB-1號(hào)及高感病品種紅大煙株接菌處理后膜的相對(duì)透性極顯著高于對(duì)照（P<0.01），且高感病品種紅大煙株接菌處理對(duì)膜的傷害率高于CB-1號(hào)。

2.2 青枯菌感染對(duì)不同烤煙品種葉片MDA含量的影響

MDA是膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA含量與細(xì)胞膜相對(duì)電導(dǎo)度成正相關(guān)關(guān)系，其含量可以反映植物在脅迫下受害程度。從圖1可以看出，接種青枯菌后對(duì)中抗品種K326烤煙葉片的MDA含量影響不大，接菌煙葉中MDA含量相對(duì)于對(duì)照沒(méi)有增加反而略有下降，相比之下，感病品種CB-1號(hào)和高感病品種紅大接菌后煙葉的MDA含量均顯著（P<0.05）、極顯著（P<0.01）高于對(duì)照。這說(shuō)明，3種不同基因型烤煙在青枯菌感染后引起膜脂氧化的程度不相同。

2.3 青枯菌感染對(duì)不同烤煙品種葉片H2O2含量的影響

H2O2是活性氧重要代表之一，激素等信號(hào)以及生物、非生物脅迫刺激均可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生和積累[12]。從圖2可以看出，3種不同基因型烤煙接種青枯菌后，中抗品種K326的H2O2的含量比對(duì)照略有下降，但不顯著；而感病品種CB-1號(hào)和高感病品種紅大接菌后H2O2的含量都比對(duì)照顯著增加，紅大增加的幅度比CB-1高，并且達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。這說(shuō)明，煙株感染青枯病后，K326品種具有較好清除植物體內(nèi)H2O2能力，而紅大清除植物體內(nèi)H2O2能力最弱，CB-1居中。

2.4 青枯菌感染對(duì)不同烤煙葉片抗氧化酶活性的影響

SOD是植物機(jī)體超氧陰離子自由基（O2-·）的清除劑，催化O2-·生成H2O2和O2，而H2O2在POD、CAT和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化成水。因此，SOD活性與植物體抗氧化脅迫能力密切相關(guān)。從圖3可以看出，接種青枯菌對(duì)K326品種葉片的SOD活性影響不大，接菌后葉中SOD活性與對(duì)照基本相同，相比之下，CB-1號(hào)和紅大品種接菌后SOD活性顯著增加，增幅分別為10.58%和11.88%，差異均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。這說(shuō)明，接菌后K326烤煙葉片產(chǎn)生的O2-·含量比較少，SOD表現(xiàn)不活躍，而CB-1號(hào)和紅大品種接菌后由于受到脅迫，產(chǎn)生較多的O2-·刺激SOD活性，使SOD提高，其中紅大烤煙葉片SOD活性比CB-1號(hào)高。

POD是植物體內(nèi)重要保護(hù)酶之一，它一方面能夠催化植物體內(nèi)H2O2分解，消除植物的O2-·含量，另一方面能將植物體內(nèi)的酚氧化成醌用來(lái)抑制病菌的活性，因此POD活性對(duì)植物抗病性起著重要的作用。從圖3看出，3個(gè)不同烤煙接種青枯菌后，K326品種煙葉中POD活性與對(duì)照相比略有下降，而CB-1號(hào)和紅大品種煙葉中POD活性都比對(duì)照增加，增幅分別為17.02%和36.63%，差異達(dá)顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）水平。

CAT也是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，其生理作用是將H2O2還原為H2O和O2 。CAT活性升高或H2O2含量降低意味著活性氧對(duì)植物細(xì)胞傷害程度的降低。從圖3也可以看出，當(dāng)3種不同烤煙品種感染青枯菌后，K326品種煙葉中CAT活性比對(duì)照表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但變化不顯著；而其他2個(gè)品種煙葉中CAT活性反而低于對(duì)照，其降幅分別達(dá)顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）水平。

3 討論

植物細(xì)胞的質(zhì)膜是植物細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)代謝的屏障，當(dāng)烤煙植株受到青枯病的脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)就產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子自由基而引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，膜的透性就會(huì)加劇，膜脂氧化產(chǎn)物MDA和H2O2含量相應(yīng)的增加，繼而引發(fā)抗氧化酶SOD、POD、CAT活性加強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中，接種青枯病菌后K326表現(xiàn)出比對(duì)照低的膜透性和MDA含量，以及較高活性CAT，說(shuō)明中抗青枯病的品種K326具有較好抑制膜脂氧化作用的保護(hù)系統(tǒng)；相比之下，感病品種CB-1號(hào)以及高感病品種紅大接菌后膜透性和MDA的含量顯著的增加，CAT活性顯著降低，且紅大品種表現(xiàn)出比CB-1號(hào)品種更加敏感。但在SOD和POD活性上，紅大和CB-1號(hào)表現(xiàn)出比K326高，這可能由于自由基產(chǎn)生刺激SOD和POD，使植物機(jī)體內(nèi)免受自由基的毒害，這與宋瑞芳[13]關(guān)于煙草抗病性與酶的活性變化研究結(jié)果是相符合。

參考文獻(xiàn)

[1]徐樹(shù)德，尚志強(qiáng)，秦西云.煙草青枯病研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（4）：49-53.

[2]楊友才，周清明，朱列書(shū).煙草品種青枯病抗病性及抗性遺傳研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)告，2005，31（40）：381-383.

[3]紀(jì)成燦，方樹(shù)民，顧鋼，等.煙草品種抗青枯病鑒定中的相關(guān)分析[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2000（2）：1-4.

[4]潘建菁，紀(jì)成燦，劉冬霞，等.青枯病侵染后煙株體內(nèi)過(guò)氧化物酶變化及其與抗性的關(guān)系[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2004（3）：28-30.

[5]丁福章，李繼新，雷波，等.超氧化物歧化酶在煙草上的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（5）：1897-1898，1914.

[6]鄒琦.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[7]林植芳，李雙順，林桂珠，等.衰老葉片和葉綠體中H202的累積與膜脂過(guò)氧化的關(guān)系[J].植物生理學(xué)，1988，14（1）：16-22.

[8]朱廣廉，鐘海文，張愛(ài)琴.植物生理學(xué)試驗(yàn)[M].北京：北京大學(xué)出版社，1990：130-140.

[9]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000.

[10]華東師范大學(xué)生物系植物生理教研組.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].上海：人民教育出版社，1980：143-144.

[11]章駿德，劉國(guó)屏，施永寧.植物生理實(shí)驗(yàn)法[M].南昌：江西人民出版社，1982：26-29.

[12]宋喜貴，余小平.植物體內(nèi)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生及其生理作用[J].連云港師范高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2010（4）：99-103.

[13]宋瑞芳，丁永樂(lè)，宮長(zhǎng)榮，等.煙草抗病性與防御酶活性間的關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（5）：309-314.

（責(zé)任編輯：劉昀）