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        太赫茲波段超材料在核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增檢測(cè)上的應(yīng)用*

        2016-10-21 11:31:53李永川王思江毛洪艷顏?zhàn)R涵劉毅魏東山夏良平黃慶
        傳感技術(shù)學(xué)報(bào) 2016年9期
        關(guān)鍵詞:生物結(jié)構(gòu)檢測(cè)

        李永川,王思江,毛洪艷,顏?zhàn)R涵,劉毅,魏東山,夏良平*,黃慶*

        (1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶400038;2.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院,跨尺度制造技術(shù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400714)

        太赫茲波段超材料在核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增檢測(cè)上的應(yīng)用*

        李永川1,王思江2,毛洪艷2,顏?zhàn)R涵2,劉毅2,魏東山2,夏良平2*,黃慶1*

        (1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶400038;2.中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院,跨尺度制造技術(shù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶400714)

        超材料對(duì)電磁場(chǎng)具有介電環(huán)境敏感和局域電場(chǎng)增強(qiáng)等奇特的電磁特性,近年來廣泛用于無標(biāo)記生物檢測(cè)。文中設(shè)計(jì)并制作了一種金屬開口諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的超材料,在太赫茲波段下分別檢測(cè)核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增前后反應(yīng)體系,在氮?dú)飧稍锃h(huán)境下,擴(kuò)增反應(yīng)前后的頻率偏移量分別為Δf1=(54±3)GHz、Δf2=(60±5)GHz。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金屬開口諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的超材料可以作為一種生物傳感器快速無標(biāo)記檢測(cè)核酸擴(kuò)增前后的變化。

        太赫茲;超材料;金屬開口諧振環(huán)陣列

        EEACC:7230doi:10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.007

        太赫茲THz(Terahertz)波是指頻率為0.1 THz~10 THz的電磁波,它具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):能量低,不會(huì)對(duì)生物大分子產(chǎn)生破壞作用[1];相干性,可通過獲得THz的相位和幅度變化,得到生物大分子的吸收系數(shù)和折射率[2];指紋譜特性,生物大分子的內(nèi)/間的弱相互作用力和骨架振動(dòng)等正好位于THz頻譜范圍[3]。因此,近年來,THz技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的研究越發(fā)受到重視。但由于目前THz生物檢測(cè)技術(shù)的靈敏度較低,不能有效檢測(cè)微量的生物大分子,因此,發(fā)展一種操作簡(jiǎn)便、可進(jìn)行高靈敏THz生物檢測(cè)的通用手段逐漸成為大家研究的焦點(diǎn)。

        超材料MMs(Metamaterials)主要是由周期性排列的亞波長(zhǎng)諧振單元和載體構(gòu)成的人工復(fù)合電磁材料[4],它具有奇異的電磁諧振特性,如異常透射[5]、局域電場(chǎng)增強(qiáng)[6]、介電環(huán)境敏感[7]等特性。在入射THz波的作用下,通過超材料的局域場(chǎng)增強(qiáng)特性,可增強(qiáng)超材料與生物分子之間的相互作用,籍此可提高THz生物檢測(cè)的靈敏度。如Hee-Jo Lee等[8]設(shè)計(jì)的雙環(huán)金屬開口諧振環(huán)DSRRs(Double Split-ring Resonators)共振頻率為12.35 GHz,能夠分辨出單鏈DNA與互補(bǔ)鏈雜交后的前后變化。Wu Xiaojun等[9]設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的矩形單開口SRRs,利用0.4 THz和1.2 THz的兩個(gè)共振頻率頻率偏移量的組合,檢測(cè)了不同濃度的鏈霉親和素。

        恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)EXPAR(Isothermal Expo?nential Amplification Reaction)是近幾年發(fā)展的一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)。它在DNA聚合酶和切口酶作用下,反復(fù)進(jìn)行“切割-延伸-鏈置換”,等溫條件下即可快速對(duì)短鏈DNA(8-16堿基)進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[10],一般能夠在10 min之內(nèi)對(duì)靶目標(biāo)DNA擴(kuò)增到106倍~109倍[11],從而能夠從溶液中眾多生物大分子中選擇性極端放大靶DNA,間接提高THz技術(shù)在生物大分子檢測(cè)應(yīng)用的靈敏性。

        本論文提出了一種幾何結(jié)構(gòu)為五環(huán)矩形金屬開口的THz超材料生物傳感器FSRRs(Five Split-ring Resonators),利用光刻工藝制作出了大面積的、結(jié)構(gòu)均一性良好的傳感器件。以核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的反應(yīng)體系為測(cè)試對(duì)象進(jìn)行傳感實(shí)驗(yàn)測(cè)試發(fā)現(xiàn),相對(duì)于FSRRs本身的THz共振透射譜而言,擴(kuò)增反應(yīng)前體系的THz譜向低頻移動(dòng)了Δf1=(54±3)GHz,而擴(kuò)增反應(yīng)后體系的THz譜向低頻移動(dòng)了Δf2=(60±5)GHz的頻移,取得了較高靈敏度的探測(cè)結(jié)果。

        1 主要試劑和材料

        VentR(exo-)DNA聚合酶、Nt.BstNBI內(nèi)切酶、10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、10×NEBuffer 3.1緩沖液等以上試劑均購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs(NEB)公司;20×Evagreen熒光染料購(gòu)自美國(guó)Biotium公司;滅菌雙蒸水ddH2O購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物公司;dNTPs購(gòu)自美國(guó)Promega公司;引物Trigger和模板Template均購(gòu)自上海生工公司;Secure-Seal?Adhesive Spacers墊片(美國(guó)Molecular Probes公司);Tray-5000太赫茲時(shí)域光譜儀(Advanced Photonix Inc,美國(guó)API公司)。

        1.1FSRRs結(jié)構(gòu)的制備及表征

        超材料的諧振頻率與其結(jié)構(gòu)和尺寸相關(guān),文中所設(shè)計(jì)的FSRRs結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示,襯底為硅,金屬結(jié)構(gòu)所選材料為金。應(yīng)用光刻工藝制作FSRRs結(jié)構(gòu),制作流程為①鍍膜:在潔凈的硅表面蒸鍍厚150 nm的金膜。②涂膠:將S1805正膠均勻旋涂在金膜表面,前烘、冷卻。③曝光:采用URE-2 000A/55移動(dòng)掩模曝光系統(tǒng),在均勻涂膠的表面進(jìn)行接觸式定時(shí)曝光,然后顯影。④濕法刻蝕:使用碘∶碘化鉀∶水=6 g∶20 g∶100 mL的混合液,刻蝕金膜,之后用去大量離子水沖洗。⑤去膠:無水乙醇去除光刻膠,即可獲得FSRRs結(jié)構(gòu)。

        圖1 SRRs結(jié)構(gòu)

        經(jīng)以上光刻工藝流程,制備得到的FSRRs如圖1(b)所示。這一結(jié)果為10×偏光顯微鏡下的光學(xué)顯微圖像,可見該FSRRs是大面積均一的,這為它在THz生物檢測(cè)中可重復(fù)利用提供了保障。該結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)放大圖,如圖1(b)中插圖所示,為50×顯微鏡下的顯微圖像。結(jié)果表明,所制備的FSRRs的棱角分明,對(duì)應(yīng)各金屬環(huán)的形狀、大小一致,結(jié)構(gòu)參數(shù)如圖1(a)所示:襯底硅的厚度h=500μm,金屬環(huán)最外的邊長(zhǎng)l=48 μm,開口寬度g=2.5 μm,結(jié)構(gòu)單元內(nèi)的環(huán)與環(huán)之間距離p= 2 μm,結(jié)構(gòu)單元之間的間距w=10 μm,金膜的厚度150 nm。

        1.2核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)體系

        核酸序列詳細(xì)信息具體見表1。

        表1 核酸序列

        核酸擴(kuò)增每管反應(yīng)體系中各反應(yīng)物質(zhì)濃度為0.05 U/μL VentR(exo-)DNA聚合酶,0.05 U/μL Nt.BstNBI內(nèi)切酶,400 μmol/L dNTPs,1×Thermopol反應(yīng)緩沖液,0.5×NEBuffer 3.1緩沖液,1×Evagreen熒光染料,1pmol/L引物序列(Trigger),100 nmol/L模板序列(Tempalte),加入ddH2O使反應(yīng)體系總體積至20 μL,60℃放入熒光定量PCR儀反應(yīng)。

        2 結(jié)果

        在完成了FSRRs結(jié)構(gòu)的制備后,下面將對(duì)其傳感性能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試,所選取的測(cè)試對(duì)象為核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的體系。采用太赫茲時(shí)域光譜系統(tǒng)(THz-TDS)TRay-5000,在透射模式下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在測(cè)量過程中,為減少空氣中水對(duì)太赫茲波的吸收干擾,須將整個(gè)裝置置于通入氮?dú)饬鞯牟A渲小T跐穸鹊陀?%,溫度為(21.02±0.01)℃的環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

        檢測(cè)樣品前,在FSRRs表面粘貼一空白區(qū)域?yàn)橹睆?5 mm、厚度100 μm的墊片,THz波下檢測(cè)并獲得未放入樣品前充滿氮?dú)猸h(huán)境的參考信號(hào)IReference和THz波透過潔凈的FSRRs表面獲得的信號(hào)IBare。測(cè)試核酸擴(kuò)增反應(yīng)前后方法為:在制備完成的SRRs表面上空白圓形區(qū)域,分別滴入核酸擴(kuò)增前或擴(kuò)增后的樣品溶液8 μL和ddH2O 22 μL,然后輕微搖勻使混合液均勻分布在空白的圓形區(qū)域,50℃烘干后分別檢測(cè),得到透射譜結(jié)果為IPre-amplification和IAfteramplification。FSRRs、核酸擴(kuò)增反應(yīng)前體系和反應(yīng)后體系歸一化透過率分別為

        將檢測(cè)獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過歸一化處理后獲得的透過率結(jié)果如圖2所示。未加入樣品前,超材料結(jié)構(gòu)的諧振頻率處位于1.33 THz處。分別加入核酸擴(kuò)增前溶液和核酸擴(kuò)增后溶液并進(jìn)行烘干后,經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與超材料結(jié)構(gòu)本身的THz透射譜相比,核酸擴(kuò)增前的溶液的THz透射譜向低頻偏移了(54±3)GHz,而擴(kuò)增后則為(60±5)GHz??梢?,所制備得到的超材料結(jié)構(gòu)對(duì)核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)前后的差異具有較高的靈敏度,適用于THz生物檢測(cè)。

        圖2 恒溫核酸指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后的檢測(cè)結(jié)果

        3 討論

        所制備的FSRRs結(jié)構(gòu)在入射THz波的驅(qū)動(dòng)下,可等效為一電容-電感LC(Inductor-Capacitor)回路,它的開口處可等效為電容器,其余金屬環(huán)部分可等效為電感,其共振頻率為[12]

        式中,Leq為等效電感,主要為FSRRs的結(jié)構(gòu)參數(shù)決定;Ceq為等效電容,與FSRRs結(jié)構(gòu)周圍的媒質(zhì)的介電常數(shù)有關(guān)。將待測(cè)物質(zhì)加入到FSRRs結(jié)構(gòu)表面時(shí),其周圍環(huán)境的介電常數(shù)將會(huì)增大,從而導(dǎo)致Ceq減小,最終引起體系的共振頻率f向低頻移動(dòng)。根據(jù)O’Hara J F的理論[13],諧振環(huán)陣列結(jié)構(gòu)的整體電容

        式中,C1為硅基底的電容,C2為硅基底與金屬陣列結(jié)構(gòu)之間的電容,C3為金屬陣列結(jié)構(gòu)的電容,C4為金屬陣列與待測(cè)物質(zhì)間的電容,C5為待測(cè)物質(zhì)的電容。由于文中檢測(cè)核酸擴(kuò)增前后使用的FSRRs結(jié)構(gòu)相同,故待測(cè)物質(zhì)電容C5的改變是引起共振頻率偏移量不同的原因。待測(cè)物質(zhì)電容C5是指FSRRs結(jié)構(gòu)上滴加的溶液中各個(gè)組成成分在烘干后的電容C值之和。而EXPAR本質(zhì)上是將反應(yīng)溶液中大量游離的dNTPs合成多核苷酸鏈,溶液中使用的酶、蛋白質(zhì)、鹽離子等在擴(kuò)增前后的量幾乎不會(huì)有變化,烘干后,這些物質(zhì)的在FSRRs結(jié)構(gòu)單元上產(chǎn)生的電容C幾乎相同,所以擴(kuò)增前溶液體系中游離的dNTPs和擴(kuò)增后溶液體系中的多核苷酸鏈的C值不同導(dǎo)致了待測(cè)物質(zhì)電容C5的不同,從而引起反應(yīng)體系前后THz透射譜的頻移量不同。

        超材料可作為一種生物傳感器應(yīng)用于THz生物檢測(cè),得益于許多生物大分子的集體振蕩模式位于THz波段。如果將具有奇異電磁諧振特性的超材料和生物大分子進(jìn)行特異性結(jié)合,將會(huì)有效提高傳感器的靈敏度。另外THz技術(shù)尚未突破THz對(duì)水敏感性的限制,生物醫(yī)學(xué)樣本中液態(tài)水和檢測(cè)環(huán)境中的水蒸氣會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的THz波水吸收干擾,結(jié)果通常是在干燥狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。然而,許多生物大分子只有在水溶液環(huán)境中才有生物活性,導(dǎo)致THz波段下超材料生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)上實(shí)際應(yīng)用遇到了瓶頸,這促使我們應(yīng)著重加強(qiáng)研究THz技術(shù)在水相環(huán)境中的應(yīng)用。

        本文結(jié)合THz波的快速、無標(biāo)記和超材料的高靈敏度檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),利用THz-TDS檢測(cè)并得到了核酸恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)前后體系的共振頻率偏移量。相較于FSRRs結(jié)構(gòu)本身而言,由于核酸擴(kuò)增前后反應(yīng)體系的等效電容Ceq不同,導(dǎo)致反應(yīng)前后體系的頻率偏移量分別為(54±3)GHz、(60±5)GHz??梢?,THz波段超材料可作為一種高靈敏度生物傳感器應(yīng)用于核酸擴(kuò)增檢測(cè)。但是基于生物醫(yī)學(xué)實(shí)際需求,還需進(jìn)一步研究THz水敏感性的問題,隨著THz技術(shù)的發(fā)展和超材料微結(jié)構(gòu)加工技術(shù)的提高,THz波段下超材料生物傳感器將會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。

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        李永川(1989-),男,在讀碩士,2013年畢業(yè)于四川大學(xué),獲得醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位,現(xiàn)就讀于第三軍醫(yī)大學(xué)攻讀碩士,主要從事于太赫茲波在生物大分子的應(yīng)用研究,yongchuanli511@163.com;

        夏良平(1986-),男,博士,重慶中科院綠色智能技術(shù)研究院助理研究員,主要從事微納光學(xué)理論、微納加工工藝與器件、金屬表面等離子體、亞波長(zhǎng)金屬結(jié)構(gòu)以及在生物傳感方面的應(yīng)用研究;

        黃慶(1972-),男,博士,第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院檢驗(yàn)科副主任、教授、主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師;兼任西南大學(xué)碩士生導(dǎo)師,主要從事分子診斷學(xué)方面研究。

        Detection of Isothermal Exponential Amplification Reaction Using Terahertz Metamaterials*

        LI Yongchuan1,WANG Sijiang2,MAO Hongyan2,YAN Shihan2,LIU Yi2,WEI Dongshan2,XIA Liangping2*,HUANG Qing1*
        (1.Department of Medical Laboratory,Southwest Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing 400038,China;2.Research Center for Terahertz Technology,Key Laboratory of Multi-scale Manufacturing Technology,Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology,Chongqing 400714,China)

        Metamaterial has a dielectric environmentally sensitive and local electric-field enhancement in electro?magnetic field,It was widely used in label-free biodetection in recent years.We designed and fabricated a metama?terial structure assembled by split ring resonator.Before and after the isothermal exponential amplification reaction system were detected at the terahertz band.In dry nitrogen gas environment,the resonance frequency offset were Δf1=(54±3)GHz and Δf2=(60±5)GHz at before and after reaction.The experimental result show that the metamateri?al assembled by split ring resonator can be used as a biosensor for rapid label-free detection in changes of before and after nucleic acid amplification.

        terahertz;metamaterials;split ring resonators

        O456

        A

        1004-1699(2016)09-1341-04

        項(xiàng)目來源:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB755400;2015CB755402);國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81430054);物理與生物醫(yī)學(xué)交叉實(shí)驗(yàn)室孵化基金項(xiàng)目(WSS-2012~501)

        2015-12-24修改日期:2016-05-03

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