王利兵

（湖北省植物保護總站武漢430070）

柑橘潰瘍病菌在湖北省越冬期適存性的研究

王利兵

（湖北省植物保護總站武漢430070）

采用栽種易感病的臍橙苗實測法和以供檢材料的浸提液或高速離心濃縮浸提液針刺接種臍橙葉片的致病性檢測方法，對柑橘潰瘍病菌在湖北省越冬期的適存性進行了研究。結(jié)果表明：柑橘潰瘍病菌在湖北省主要在病株的病斑內(nèi)越冬，也有少量能以潛伏侵染的方式在病株的未顯癥葉片內(nèi)越冬，成為翌年的初次侵染來源；病原菌不能在田間的病落葉、土壤和雜草上越冬。

柑橘潰瘍病菌；越冬期；適存性；研究

柑橘潰瘍病是由地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.citri）引起的一種細菌性病害，是國內(nèi)和國際間的一種重要的檢疫對象。此病全球分布甚廣，國內(nèi)長江流域以南的主要柑橘產(chǎn)區(qū)也有不同程度的發(fā)生。此病能引起病株大量落葉落果，嚴重削弱樹勢，使產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，影響外銷，給柑橘生產(chǎn)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外對該病的發(fā)生規(guī)律和防治方法進行了大量的研究，由于各地氣候和生態(tài)條件不同，發(fā)生規(guī)律不盡相同。弄清病原菌在不同地區(qū)生態(tài)條件下的越冬狀況和初侵染來源，對該病的防治和根除至關(guān)重要。湖北省是柑橘主產(chǎn)區(qū)之一，柑橘潰瘍病分布不廣，必須嚴防此病的擴散蔓延。由于湖北省過去對它的研究不多，對病原菌越冬和初侵染源方面的問題研究報道極少。為此，筆者對柑橘潰瘍病菌在湖北省生態(tài)條件下越冬期的適存性進行了研究。

1　材料與方法

1.1供試柑桔品種

臍橙（紐荷爾）：感病品種，盆栽3年生健康苗，購自華中農(nóng)業(yè)大學苗木公司；臍橙（華盛頓）感病品種，3年生健康苗，由華中農(nóng)業(yè)大學柑橘研究所提供。

1.2培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基為含有馬鈴薯、蛋白胨、蔗糖、酵母浸膏等成分的細菌培養(yǎng)基，簡稱PPSY培養(yǎng)基。

1.3調(diào)查方法

于2012年～2014年分別對病菌在湖北省不同區(qū)域病株的葉部病斑和無癥狀葉、病圃土壤、病落葉、病圃地常見雜草上越冬期的適存性進行了調(diào)查與檢測，并對病菌在冬季土壤中和冬季病落葉中的存活期進行了檢測。

1.4檢測方法

1.4.1臍橙苗實測法

將健康臍橙苗栽植于供檢測的越冬后的病圃土壤和越冬后的病落葉檢測點上，對二者能否傳病進行實測。在栽后的第1年每15d調(diào)查1次，第2年每30d調(diào)查1次有無發(fā)病，以此來證明病菌能否在土壤和病落葉中越冬，以及越冬后有無傳病能力。

1.4.2致病性檢測

分別取供檢材料制備浸提液或浸提液的高速離心濃縮液對臍橙苗活體葉或離體葉進行針刺貼敷接種（用直徑5 mm的無菌濾紙片吸取浸提液或高速離心濃縮液，貼敷在葉片的針刺點上）?；铙w葉接種在25℃～30℃、噴霧保濕條件下孵育，離體葉接種在28℃～30℃下，吸水紙法保濕孵育。前者在接種20d以后，后者在接種后8d～10d檢查結(jié)果，觀察記載針刺接種點的發(fā)病情況，以此來判斷供檢材料有無病菌安全越冬或病菌的存活期。

1.5檢測程序

1.5.1接種液前處理

a）病菌在病株葉部病斑越冬期適存性檢測。取先一年秋梢葉的病斑10個，分別單斑搗碎，各用0.5ml無菌水浸泡0.5h，制成單斑浸提液供接種。

b）病菌在病株的無癥狀葉片上越冬期適存性檢測。5月，在病株上隨機采取先一年的無癥葉40片，搗碎，用40ml無菌水浸泡0.5h，制成浸提液供檢測用。

c）病菌在病落葉上的越冬期適存性檢測。2013年底將病葉200片撒于1m2左右的田間土面上，為防風吹走，用一層尼龍紗蓋上，四周用土壓住，任其自然越冬。2014年2月在病葉周圍一圈栽健康臍橙苗6株，實測其有無傳病作用。2014年5月分別取年前采集并分別放在室外地表和室內(nèi)越冬的病葉60片和30片，其中室外越冬的病葉又分腐爛看不清病斑和未腐爛仍可見病斑的各30片，分別搗碎，加20ml無菌水浸泡0.5h，制備浸提液供檢測。

d）病菌在冬季土表病落葉中存活期的檢測。2013年12月1日和2013年12月27日分別將裝于尼龍網(wǎng)袋中的各200片病葉撒于田間土表越冬，然后分期多次取病葉（每次30片）按前法制備浸提液供檢測。

e）病菌在病圃土壤中越冬期適存性檢測。2012年冬，將病圃中一廂株發(fā)病率為100%的柑橘苗移走，讓其冬季休閑，2013年3月在其上栽種健康臍橙苗20株，實測其病圃土壤有無傳病作用。2013年5月上、中旬，分2次每次對上述病圃土壤隨機多點取0cm～10cm深的土樣500g，用無菌水500ml浸泡0.5h，過濾，制備土壤浸提液供檢測。

f）病菌在冬季土壤中存活期的檢測。2014年1月1日將400片病葉剪碎后的無菌水浸提液和4支斜面純培養(yǎng)的病菌洗出液汁800ml，均勻灑潑在2m2的田間土壤中，然后分期多次取土樣按上法制備土壤浸提液供檢測。

g）病菌在病圃地雜草上的越冬期適存性檢測。

5月，在前述病圃取豬殃殃、看麥娘、狗牙根、小薊、婆婆納等雜草300g（含根），攪爛，加300ml無菌水浸泡0.5h，過濾，制備浸提液供檢測。

h）陽性CK。細菌濃度為1.5x106cfu/ml的病菌純菌種的菌懸液。

1.5.2制取接種濃縮液

浸提液先以3 000r/min離心8min取上清液；再以12 000r/min離心8min～10min，去上清液。取底部2ml的離心濃縮液供接種。

1.5.3供試樣品接種

針刺貼敷接種臍橙苗活體葉或離體葉，在適溫、高濕下孵育，檢查記載針刺接種點的發(fā)病情況，以此判斷供檢樣品有無病菌越冬或病菌的存活期。

2　結(jié)果與分析

2.1病菌在病株病斑內(nèi)的越冬期適存性檢測

表1　病株葉部病斑越冬后單斑浸提液致病力的檢測

從表1可看出，病株葉部病斑越冬后的單斑浸提夜經(jīng)針刺接種感病品種臍橙葉片，有90%～100%的病斑有致病能力，能引起臍橙葉片發(fā)病，其針刺接種點的發(fā)病率達68%～75%。說明病株上的病斑內(nèi)的病菌在湖北省能安全越冬，成為第2年重要的初次侵染來源。這與Goto（1962）和Giverolo（1990）報道的結(jié)果是一致的。

2.2病菌在病株無癥狀葉上的越冬期適存性檢測

由表2可見，病株上肉眼看沒有病斑的無癥狀葉的浸提濃縮液接種臍橙葉，2次接種均引起了接種葉發(fā)病，說明無癥狀葉上有一定數(shù)量的病菌潛伏侵染，它們能安全越冬，成為第2年的初侵染源。但與前一項越冬后的葉部病斑浸提液檢測結(jié)果相比，針刺接種點的發(fā)病率要低得多，

說明無癥狀葉上潛伏侵染的菌量比病斑上的菌量少得多。

表2　越冬后病株無癥狀葉的浸提濃縮液致病力的檢測

2.3病菌在病落葉中的越冬期適存性檢測

經(jīng)2014年11次和2015年6次逐株仔細檢查，栽培健康臍橙苗對越冬后的病落葉傳病能力的實測結(jié)果均未見供檢測用的臍橙苗發(fā)病，說明病落葉經(jīng)越冬后已無傳病作用。

越冬后的病落葉的浸提濃縮液致病能力的檢測結(jié)果見表3。從表3可看出，室外土表越冬的病落葉，無論是腐爛看不清病斑的，還是未腐爛仍可見病斑的，經(jīng)5月份2次采用病葉浸提濃縮液針刺接種檢測均未引起臍橙葉發(fā)病。說明在湖北省冬季生態(tài)條件下，病菌不能在室外的病落葉中安全越冬，成為翌年的初次侵染來源，這與前面用栽植健康臍橙苗實測的結(jié)果相吻合和相互印證。但病菌能在室內(nèi)保存的病葉中安全越冬，針刺接種點的發(fā)病率可達40%～90%。這主要與室內(nèi)冬季溫度比室外高，濕度小，病葉干燥，葉片上的微生物區(qū)系遠沒有在田間土表微生物區(qū)系那樣復雜有關(guān)。

表3　越冬后病落葉浸提濃縮液致病能力的檢測

2.4病菌在冬季土表病落葉中存活期的檢測

從表4更進一步證明冬季土表病落葉中的病菌不能安全越冬，其病菌存活期最長只有85d～94d（2013-12-01～2014-02-24和2014-03-02之間），因此，年前的病落葉不可能成為第2年的初侵染源，與前述“2.3”的研究結(jié)果相吻合，互相印證。

2.5病菌在病圃土壤中的越冬期適存性檢測

經(jīng)過2013年11次和2014年6次逐株檢查，栽植健康臍橙苗對越冬后的病圃土壤傳病能力的實測結(jié)果，栽在病圃土壤中的20株健康臍橙苗均沒有發(fā)病。說明帶菌土壤在湖北省自然生態(tài)條件下，經(jīng)一個冬季后已無傳病能力，病菌在田間土壤中不能安全越冬成為第2年的侵染源。越冬后的病圃土壤的浸提濃縮液致病能力的檢測結(jié)果見表5。

表5　越冬后病圃土壤浸提濃縮液致病能力的檢測

從表5可看出，2013年5月5日和5月16日2次以越冬后的病圃土壤的浸提濃縮液針刺接種方法測定均未引起最感病的臍橙春梢葉發(fā)病。說明病菌在湖北省生態(tài)條件下，不能在土壤中安全越冬，成為翌年的初侵染來源。這一結(jié)果與上述實測結(jié)果相互吻合、印證。然而，與此同時2次測定病株下土壤的浸提液均有致病能力，接種點發(fā)病率分別達27.8%和66.7%，這是因為病株下土壤可接收病株上因降雨而淋洗下來的病原菌。由此也說明此種檢測方法是有效和可行的。

表4　病菌在冬季病落葉中存活期的檢測

2.6病菌在冬季土壤中存活期的檢測

從表6可看出，病菌在冬季土壤中的存活期為16d～22d（2014-01-01～01-06和01-22之間），這更進一步說明了潰瘍病菌在湖北的生態(tài)條件下的土壤中不能越冬而成為次年初次侵染來源，與前術(shù)“2.5”的檢測相吻合，并相互印證。

表6　病菌在冬季土壤中的存活期檢測

2.7病菌在病圃內(nèi)雜草上的越冬期適存性檢測

從表7可看出，越冬后病圃雜草（豬殃殃、看麥娘、狗牙根、小薊、婆婆納等）的浸提濃縮液經(jīng)2次檢測接種均未引起臍橙葉發(fā)病，而陽性CK針刺接種點發(fā)病率高達93.3%和100%。說明在武漢地區(qū)的生態(tài)條件下，病菌不能在病圃的常見雜草上越冬，成為第2年的初次侵染來源。

表7　越冬后病圃雜草的浸提濃縮液致病能力的檢測

3　結(jié)論與討論

在湖北省的生態(tài)條件下，柑橘潰瘍病菌主要在病株的病斑內(nèi)越冬，成為翌年柑橘發(fā)病的主要初次侵染來源。此外，也有少部分病菌可在病株的無癥狀葉片上以潛伏侵染的狀態(tài)越冬，成為次年的侵染源之一。這一研究結(jié)果與前人的報道一致，也為生產(chǎn)實踐所證實。

同時，在湖北省生態(tài)條件下，柑橘潰瘍病菌不能在田間病落葉上、土壤中、果園常見的雜草上越冬，成為翌年的初侵染源。進一步的試驗證明，病菌在冬季田間病落葉上的存活期只有85d～91d，在冬土壤中的存活期只有16d～22d。這些研究結(jié)果，與國內(nèi)外的多數(shù)報道基本一致，而與少數(shù)報道不盡相同。分析其原因，主要與各地的生態(tài)環(huán)境條件不同有關(guān)，也與不同研究者的研究方法有關(guān)。本試驗是在2012年～2014年3年的冬季和春季在湖北省不同區(qū)域隔離病圃的田間進行的。湖北省冬季和春季的氣候雖然每年不盡相同，但低溫和常有風、霜、雨、雪，天氣變化幅度較大是其特點。在這種氣候條件下，田間濕度較大、微生物區(qū)系復雜，對潰瘍病菌的越冬顯然是不利的。試驗中發(fā)現(xiàn)，病菌可在室內(nèi)保存的病葉中安全越冬，翌年春梢期間是浸提濃縮液人工接種仍有很高的發(fā)病率，這無疑與室內(nèi)干燥，微生物區(qū)系沒有田間復雜，以及沒有陽光照射等因素有關(guān)。

本試驗研究采用了在田間病圃土壤和大量放置越冬病落葉處栽植極易感病的健康臍橙苗實測的方法與采用供檢材料的浸提液或高速離心濃縮液針刺接種感病品種-臍橙葉片的致病性檢測方法相互印證。試驗證明，這是比較科學而符合客觀實際的方法。它具有直觀可靠、簡便易行的優(yōu)點，適宜在基層植保、植檢站應用。

S4

A

1005-6114（2016）03-015-004

2016-01-13

王利兵（1972-），男，高級農(nóng)藝師，長期從事農(nóng)業(yè)植物保護技術(shù)研究及推廣工作。