羅明華　王　賀　司春嬰　關(guān)懷敏　解金紅　陳玉善　邱承杰　董文杰河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科，河南鄭州450000

光學(xué)干涉斷層成像對球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)兔腹主動脈粥樣硬化模型的認(rèn)定價(jià)值

羅明華王賀司春嬰關(guān)懷敏▲解金紅陳玉善邱承杰董文杰
河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科，河南鄭州450000

目的探索光學(xué)干涉斷層成像（OCT）技術(shù)在球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)兔腹主動脈粥樣硬化模型中的價(jià)值。方法20只日本大耳白兔，通過完全隨機(jī)化的方法隨機(jī)分配至實(shí)驗(yàn)組與對照組，各10只，實(shí)驗(yàn)組采用球囊損傷加高脂喂養(yǎng)8周的方法制作動脈粥樣硬化模型，對照組采用球囊損傷加普通喂養(yǎng)的方法。8周后OCT觀察內(nèi)膜增殖及管腔狹窄程度，而后病理觀察斑塊性質(zhì)，考察OCT與病理檢查對粥樣硬化結(jié)果的吻合程度。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)后三酰甘油［（1.12±0.42）mmol/L比（0.59±0.35）mmol/L，P＜0.05］、總膽固醇［（12.17±3.14）mmol/L比（1.23±0.25）mmol/L，P＜0.05］、低密度脂蛋白膽固醇［（11.43±3.12）mmol/L比（0.38±0.14）mmol/L，P＜0.05］較基線升高；病理顯示實(shí)驗(yàn)組較對照組管壁更厚，內(nèi)膜增殖更顯著；OCT發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組管腔面積低于對照組［（4.34±0.22）mm2比（5.13±0.17）mm2，P＜0.01］，新生內(nèi)膜面積［（2.55±0.19）mm2比（1.66±0.22）mm2，P＜0.01］及平均新生內(nèi)膜厚度［（94±20）μm比（57±13）μm，P＜0.01］高于對照組，這與病理組織檢查對內(nèi)膜增殖結(jié)果的考察具有良好的一致性。結(jié)論球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)的方法可以短期內(nèi)制作出動脈粥樣硬化模型，OCT能夠清晰觀察到兔腹主動脈粥樣硬化模型內(nèi)膜增殖特點(diǎn)及管腔狹窄程度，可以作為兔動脈粥樣硬化模型成功與否的檢測方法。

光學(xué)干涉斷層成像；兔；粥樣硬化；模型；內(nèi)膜增殖

［Abstract］Objective To explore the value of optical coherence tomography（OCT）for rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis induced by balloon injury and high-fat feeding.Methods Twenty Japanese white rabbits were randomly divided into experimental group and control group by completely randomized method，with 10 rabbits in each group.The experimental group was taken balloon injury and high-fat feeding for 8 weeks to make aortic atherosclerosis models，while the control group was taken the method of balloon injury and normal feeding. After 8 weeks，the condi tions of intimal hyperplasia and luminal stenosis were observed by OCT，the plaque characteristic was observed by pathologic examination，the coincided degree of OCT and pathologic examination for the results of aortic atherosclerosis was investigated.Results The levels of triacylglycerol［（1.12±0.42）mmol/L vs（0.59±0.35）mmol/L，P＜0.05］，total cholesterol［（12.17±3.14）mmol/L vs（1.23±0.25）mmol/L，P＜0.05］，low density lipoprotein cholesterin［（11.43±3.12）mmol/L vs（0.38±0.14）mmol/L，P＜0.05］in the experimental group after feeding were significantly increased compared with baseline；the pathologic examination showed that the tube wall of experimental group was thicker than that of control group，the intimal hyperplasia was more significant；OCT showed that，the lumen area of experimental group was lower than that of controlgroup［（4.34±0.22）mm2vs（5.13±0.17）mm2，P＜0.01］，the neonatal intimal area［（2.55±0.19）mm2vs（1.66± 0.22）mm2，P＜0.01］and average neonatal intimal area［（94±20）μm vs（57±13）μm，P＜0.01］were higher than those of control group，which had good consistency with pathologic examination for intimal hyperplasia.Conclusion The method of balloon injury combined with high-fat feeding can make aortic atherosclerosis models in short time，OCT can observe the characteristics of intimal hyperplasia and the degree of luminal stenosis of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis clearly，which can be used as the method for detecting the success or failure of rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis.

［Key words］Optical coherence tomography；Rabbit；Atherosclerosis；Model；Intimal hyperplasia

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心、腦、腎等臟器缺血性疾病的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康。建立AS動物模型對研究其病理改變、探索其發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。兔是較常采用的實(shí)驗(yàn)動物，高脂喂養(yǎng)或球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)的方法是目前使用較多的造模方法，但是，往往缺乏統(tǒng)一造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。有僅僅高脂喂養(yǎng)8周或12周的［1-3］，有兔動脈球囊損傷后高脂喂養(yǎng)8周或16進(jìn)行造模的［4-5］，亦有先高脂喂養(yǎng)4周，而后球囊損傷造模［6］，有研究采用血管鉗夾技術(shù)聯(lián)合高脂喂養(yǎng)6周進(jìn)行造模者［7］，也有研究認(rèn)為通過高脂喂養(yǎng)4～16周可以制作出不同病理分期的AS模型［8］。因此，適應(yīng)相應(yīng)臨床研究需求的兔AS模型的制作仍然有待進(jìn)一步研究。同樣，兔AS模型成功與否的判斷亦缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有研究通過血脂升高判斷是否成功，有通過造影的方法，有研究間接超聲探查頸動脈斑塊判斷［9］，亦有采用核磁共振技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)者［10］。但是這些技術(shù)各有一定的缺點(diǎn)，血脂升高并不一定形成AS，造影的方法比較可靠，但造影發(fā)現(xiàn)狹窄前就已經(jīng)存在粥樣斑塊，按照造影的標(biāo)準(zhǔn)需要延長模型的飼養(yǎng)時(shí)間，增加成本。光學(xué)干涉斷層成像（OCT）是一種新型的影像學(xué)技術(shù)，具有微米級別的分辨率和出色清晰度，可明確AS斑塊特點(diǎn)以及內(nèi)膜增殖程度［11］。本研究擬建立一種穩(wěn)定、可靠的兔AS模型，并通過與病理活檢對比的方法，驗(yàn)證OCT方法在兔AS模型檢測中的價(jià)值。

1　材料與方法

1.1對象與分組

雄性日本大耳白兔［河南康達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK（豫）2011-0001］20只，5月齡，體重2.5～3.0 kg，將兔按照體重依次編號，利用計(jì)算機(jī)隨機(jī)生成兩位數(shù)隨機(jī)表，以隨意一行開始，將數(shù)字與動物編號匹配，與隨機(jī)數(shù)中的奇數(shù)匹配的動物被分至實(shí)驗(yàn)組，余下被分至對照組，實(shí)驗(yàn)組與對照組各10只。實(shí)驗(yàn)組球囊損傷腹主動脈后高脂喂養(yǎng)8周；對照組球囊損傷后普通喂養(yǎng)8周。實(shí)驗(yàn)兔在溫度為22～27℃、濕度為50%的條件下喂養(yǎng)，高脂配方為在普通飼料中加入2%膽固醇、10%豬油和10%蛋黃粉。本研究通過了河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)并按照動物福利相關(guān)規(guī)范實(shí)施。

1.2兔腹主動脈粥樣硬化模型的制作

日本大耳白兔（清潔級），預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，術(shù)前3 d予阿司匹林25 mg/d，術(shù)前24 h禁食。20%烏拉坦5 mL/kg耳緣靜脈麻醉，右股動脈剃毛、消毒、鋪巾，鈍性分離右股動脈。直視下穿刺股動脈，置入4F橈動脈鞘管，予以1000 U肝素抗凝。在C形臂X光機(jī)下，送入球囊導(dǎo)管至腎動脈以遠(yuǎn)腹主動脈，球囊直徑與血管直徑比約為1.2∶1，加壓15～20 atm，緩慢回拉至腹主動脈分叉處，重復(fù)3遍，撤出器材，壓迫血管10 min后縫合創(chuàng)口，包扎。術(shù)后每天1次肌注青霉素80萬U，共5 d。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后高脂喂養(yǎng)，對照組普通喂養(yǎng)。8周后OCT檢查與病理檢查。

1.3血脂檢測

入組時(shí)以及球囊損傷后8周空腹時(shí)從兔耳中動脈采集血液2 mL，全自動生化儀測定總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.4 OCT檢查

腹主動脈損傷后8周，采用上述方法麻醉，游離右側(cè)股動脈，置入6F橈動脈鞘管，采用OCT儀（Light Lab Image Inc，USA）進(jìn)行檢查。置入指引導(dǎo)管，送導(dǎo)絲至腎動脈水平以遠(yuǎn)，送入成像導(dǎo)管（Image Wire，Light Lab Image Inc，USA）至目標(biāo)血管。定位后，按照既定的方法［12］進(jìn)行圖像采集，應(yīng)用C7X（Light Lab Image，USA）軟件進(jìn)行OCT圖像分析。所有的圖像資料均由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的臨床醫(yī)師分析。觀察管腔內(nèi)膜增殖情況，采用每1毫米（10幀圖像）一幀觀察統(tǒng)計(jì)，如果圖像質(zhì)量不佳則前后移動1～2幀，選取最佳者為研究圖像。觀察每個斷層內(nèi)膜厚度、斑塊面積。

1.5兔腹主動脈粥樣硬化組織病理檢查

將兔固定于兔臺，剪去腹部被毛，75%乙醇局部皮膚消毒，1%鹽酸利多卡因皮下局麻，沿腹正中線切口約10 cm，分離損傷處腹主動脈，脫水、包埋，切片和HE染色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，成組資料采用配對t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1模型制作基本情況

研究納入日本大耳白兔20只，死亡2只。對照組：死亡1只，在進(jìn)行球囊損傷過程中突發(fā)死亡，可能與動脈損傷導(dǎo)致夾層有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組死亡1只，在球囊損傷后高脂喂養(yǎng)過程中厭食，最終死亡。

2.2血脂結(jié)果

對照組飼養(yǎng)前后TC、TG、LDL-C及HDL-C比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)后TC、TG、LDL-C水平較基線明顯升高（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)后TC、TG、LDL-C水平顯著高于對照組飼養(yǎng)后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　兩組基線以及飼養(yǎng)8周后血脂水平比較（x±s）

2.3病理檢查結(jié)果

大體觀，對照組動脈柔軟富有彈性，顏色粉紅，內(nèi)膜光滑，個別標(biāo)本可見脂質(zhì)條紋，無明顯斑塊。實(shí)驗(yàn)組兔腹主動脈粗細(xì)不均，血管壁明顯增粗，變硬，顏色黃白相間，肉眼可見管壁明顯增厚，可見融合成片狀的黃白條紋或斑塊隆起于管腔。動脈管壁病變硬化分為5個級別［13］：0級，內(nèi)膜光滑，無奶油樣變化；1級，有明顯的凸起奶油樣斑塊，面積小于3 mm2；2級，斑塊面積大于3 mm2；3級，斑塊融合成片，大部分斑塊面積大于3 mm2；4級，斑塊幾乎覆蓋整個動脈內(nèi)膜。本研究中，實(shí)驗(yàn)組集中于2級與3級，而對照組集中于0級與1級。HE染色觀察，對照組9例中僅有2例可觀察到內(nèi)膜輕微增殖變厚，中層平滑肌存在，其余則未見明顯病理改變；實(shí)驗(yàn)組中9例均可見內(nèi)膜增殖明顯，管腔內(nèi)部可見顯著的脂質(zhì)斑塊存在，內(nèi)膜下可見大量的泡沫細(xì)胞與淋巴細(xì)胞聚集，中膜平滑肌增生（圖1）。

圖1　腹主動脈HE染色

2.4 OCT檢查結(jié)果

對照組OCT成像顯示內(nèi)膜較光滑，有一定程度的增殖，無斑塊形成；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜增生明顯，斑塊負(fù)荷較重，新生內(nèi)膜厚度更厚（圖2），新生內(nèi)膜面積顯著高于對照組，平均新生內(nèi)膜厚度高于對照組，管腔面積小于對照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

圖2　光學(xué)干涉斷層成像檢查結(jié)果

表2　兩組光學(xué)干涉斷層成像觀察指標(biāo)比較（x±s）

2.5 OCT檢查與病理結(jié)果比較

對照組與實(shí)驗(yàn)組腹主動脈管腔內(nèi)膜最厚處進(jìn)行病理與OCT檢查結(jié)果進(jìn)行分析，對照組均表現(xiàn)為輕度內(nèi)膜增殖，實(shí)驗(yàn)組則表現(xiàn)為新生內(nèi)膜更厚，動脈粥樣斑塊顯著增殖，管腔面積下降明顯。OCT結(jié)果與病理解剖結(jié)果具有較好的一致性。

3　討論

AS動物模型研究很多，但目前尚無能夠完美復(fù)制出精確病理的AS動物模型。兔是制作AS模型的候選動物，它成本低、操作方便，且脂代謝與人類有相似之處。但單純高脂飼養(yǎng)短期內(nèi)難以造出AS模型，且易生病，導(dǎo)致動物死亡。報(bào)道稱單純高脂喂養(yǎng)需要3～4個月的時(shí)間才能造成兔AS模型［14］。因而，往往采取球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)的方式［5-6］造模。本研究即采取該方式進(jìn)行造模，結(jié)果顯示囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)8周，大體標(biāo)本可以看到2、3級的動脈硬化，光鏡可以看到所有動物表現(xiàn)為內(nèi)膜增殖、顯著脂質(zhì)斑塊、內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞與淋巴細(xì)胞聚集、中膜平滑肌增生等病理改變，提示該方法能夠成功復(fù)制出滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求的AS模型。

目前對AS模型的評價(jià)缺乏合適的方法，OCT能夠成功檢測到早期脂質(zhì)條紋以及斑塊［15］，且比血管造影的敏感性更高［16］。如果通過OCT檢測到動脈內(nèi)膜增殖、早期斑塊的形成，可以認(rèn)定AS模型的成功。Tian等［17］使用OCT檢測通過氯化鐵誘導(dǎo)的兔AS模型，顯示了良好的結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)OCT檢測結(jié)果與病理組織檢查具有良好的同一性。Zhang等［18］利用OCT及IVUS觀察兔AS模型的粥樣斑塊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OCT在對粥樣斑塊厚度及斑塊性質(zhì)的判斷方面較IVUS具有較高的敏感性及實(shí)用價(jià)值。本研究通過物理損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)能夠在相對較短的8周時(shí)間內(nèi)制造出AS模型，OCT觀察到內(nèi)膜不均勻增殖，且與病理結(jié)果具有良好的一致性。

AS模型成功后，欲連續(xù)觀察斑塊進(jìn)展以及消退，以往研究往往采取分批處死的方式，而缺乏同一動物動脈同一斑塊連續(xù)檢測的影像學(xué)數(shù)據(jù)。那么，通過OCT這一技術(shù)則能夠解決這一瓶頸。本研究成功對兔腹主動脈進(jìn)行侵入性球囊損傷后，再次介入的辦法進(jìn)行OCT檢查，而且亦可通過其他的動脈入路進(jìn)行再次的OCT檢查。為此后的研究鋪平了道路。Fulcher等［19］對高脂喂養(yǎng)兔腹主動脈AS模型研究中，采用不同入路對腹主AS靶點(diǎn)成功進(jìn)行多次OCT圖像采集。研究中，由于球囊損傷范圍較大，可能造成較大范圍與長度的AS改變。為了統(tǒng)一OCT探測范圍以及組織學(xué)考察目標(biāo)，本研究采用了Asml等［20］的研究方法，通過分叉血管作為標(biāo)志點(diǎn)，在此標(biāo)志點(diǎn)附近進(jìn)行球囊損傷與OCT觀察。另外，OCT檢查耗材費(fèi)用較高，為了節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，本研究重復(fù)使用了經(jīng)過消毒的OCT成像導(dǎo)管，從而盡可能降低實(shí)驗(yàn)的成本。

總之，本研究通過球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)的方式，短期內(nèi)成功復(fù)制出兔腹主動脈AS模型，且該模型通過OCT以及病理組織學(xué)檢驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)了新生內(nèi)膜增殖、管腔面積減少等，具有良好的一致性，OCT技術(shù)可以作為兔AS模型成功與否的檢測方法。

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Identified value of optical coherence tomography for rabbits models with abdominal aortic atherosclerosis induced by balloon injury and high-fat feeding

LUO MinghuaWANG HeSI ChunyingGUAN Huaimin▲XIE JinhongCHEN YushanQIU ChengjieDONG Wenjie
Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of He'nan University of Chinese Medicine，He'nan Province，Zhengzhou450000，China

R541.4

A

1674-4721（2016）09（a）-0004-05

2016-04-20本文編輯：趙魯楓）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81473507）。

羅明華（1982-），男，醫(yī)學(xué)碩士；研究方向：冠心病介入診治。